中文摘要：

从天然产物中寻找高效低毒、结构新颖、作用机理独特、能够逆转真菌耐药性的新化学实体成为医药行业迫切的任务。申请者多年来从事中国卷柏属植物的化学成分及其活性研究，发现其中炔多酚类成分Selaginellins具有较好的抗真菌及逆转真菌耐药性的活性。然而，迄今发现的Selaginellins均以消旋体的形式存在，其立体构型未能阐明是以往研究的缺憾。本项目拟对Selaginellins进行拆分，并进行体内、外活性评价，在明确其立体构型与活性的相关性的基础上，研究其对真菌细胞膜麦角甾醇生物合成通路的干预，确定其作用的关键酶和基因；并拟从Selaginellins对真菌耐药性起关键作用的耐药蛋白Cdr1p影响的角度，阐明其逆转耐药的机制。本研究综合运用立体化学、分析化学、药理学、微生物学及分子生物学的研究方法，旨在发现新型抗真菌药物先导化合物，为进一步的结构改造奠定基础。

结论摘要：

本项目在前期研究的基础上，进一步完成了卷柏药材中selaginellin类化合物的系统分离研究工作，丰富其化学多样性；并研究了这一系列selaginellin类化合物对临床常用真菌的抑制作用，发现其均有一定程度的抗真菌活性。通过单晶X-衍射，手性拆分等方法，首次揭示了selaginellin类化合物以消旋体形式存在的内在机制互变异构现象和旋转受阻现象。建立了其中旋转受阻类selaginellins的手性拆分方法，并用量子化学计算的方法确定其绝对构型。同时进行立体构型与抗真菌活性相关性的研究拆分得到的对映异构体室温下不稳定，发生消旋化。因此对于拆分前后化合物的活性比较，只是反映了一个趋势，尽管如此，拆分后的两对对映异构体对白色念珠菌的抑制活性较消旋体提高了1~2倍，对熏烟色曲霉的抑制活性提高了1倍，即单一构型的化合物的活性确实高于消旋体。鉴于手性拆分的成本，及目前活性筛选技术的限制，本研究没有从此方面深入进行；转而从寻找抗真菌药物增效剂的方面着手，发现selaginellin具有较好的对唑类药物体外抗白念珠菌的增效作用。采用RT-PCR，Western blot，流式细胞术，生化检测技术，及棋盘式微量液基稀释法考察还原剂的加入对两药协同效果的影响，探讨二者协同抗白念珠菌的机制，结果显示两药合用显著上调Sirt2，对凋亡的影响不明显，阻滞细胞周期于S期，线粒体有氧呼吸增强，ATP 生成量减少，ATP 合酶活性受到抑制，内源性活性氧（ROS）生成大量增加。初步推断二者合用是通过阻滞白念珠菌细胞周期，增强白念珠菌的能量消耗、抑制 ATP 合酶活性使细胞内 ROS 生成增多，促进氧化损伤而杀伤白念珠菌。这一“活性氧机制”可能是其协同抗白念珠菌的重要分子机制之一。Sirt2在selaginellin和氟康唑协同抗白念珠菌的机制中的作用，以及与“活性氧机制”的相关性有待进一步研究。同时针对卷柏属植物selaginellin的分布，及selaginellins的细胞毒活性进行了延展性研究。