中文摘要：

构建代谢通道是解决代谢工程研究中优化代谢流量这一关键问题的有效方法之一。而构建代谢通道的手段各有优缺点，其优化代谢流的作用机制也不十分清楚。在我们构建的厌氧合成重要平台化合物琥珀酸的基础菌株中，由丙酮酸脱羧酶PDC和乙醛脱氢酶MhpF催化的丙酮酸生成乙酰辅酶A过程代谢流量的优化，是提高琥珀酸转化率和改善氧化还原平衡的关键。为此本项目首次采用分子定向进化和蛋白骨架两种策略构建PDC-MhpF代谢通道优化代谢流。利用酶学特性分析、蛋白结构预测、代谢物检测和代谢通道分析的方法，揭示代谢通道优化代谢流的作用机制以及杂合酶融合的分子机理，比较两种代谢通道构建手段对代谢流优化的结果；进一步利用13C代谢流分析该代谢通道对琥珀酸厌氧合成途径的作用和影响，为下一步改造提供研究方向。本项目开展的代谢通道构建和优化代谢流量的作用机制的研究，可以为代谢工程研究中增强和优化代谢流量，提供一个新的手段和理论基础。

结论摘要：

在代谢工程的研究中，优化代谢流量已成为代谢工程研究中的关键问题。琥珀酸是一种具有重要应用价值的四碳二羧酸。美国能源部2004年从300多种生物中间体中挑选出来的12种具有市场潜力的平台化合物中，琥珀酸位居第一。在我们构建的合成重要平台化合物琥珀酸的基础菌株中，代谢流量的控制和优化是提高琥珀酸转化率和改善氧化还原平衡的关键。本项目从四个方面针对上述问题进行了研究，并取得较好结果（一） PDC和MhpF代谢流量的优化由丙酮酸脱羧酶PDC和乙醛脱氢酶MhpF催化的丙酮酸生成乙酰辅酶A过程代谢流量的优化，是提高琥珀酸转化率和改善氧化还原平衡的关键。针对PDC和MhpF的代谢流量的优化，我们采用了的两种策略，PDC-MhpF融合酶的构建以及利用一种新的串联核心启动子方法优化代谢流量。使琥珀酸厌氧生产得到显著提高。（二）TCA还原支路和糖酵解的代谢流量优化。通过调控优化TCA还原支路和糖酵解代谢流分配和加快碳源葡萄糖的跨膜运输，好氧-微好氧-厌氧全阶段生产琥珀酸的产量达到32.30g/L，这一产量较单一好氧生产提高4.33倍，较好氧-微好氧双阶段生产提高1.93倍。最终发酵罐结果显示，工程菌的琥珀酸产量达到85.3 g/L，特别是总生产力（2.13 g/(L？h)）是目前利用大肠杆菌生产琥珀酸相关文献报道中最高的。因此工程菌和好氧-微好氧-厌氧全阶段琥珀酸发酵工艺具有可观的工业化应用价值和前景。（三）糖运输和PEP代谢流量的优化。首次较为系统地探究了大肠杆菌W3110菌株的PTSGlc单基因缺陷菌株对不同碳源的运输流量的调控和影响。可以在发酵含不同比例葡萄糖和木糖的生物质水解液过程中，选择适合的菌株以提高目的产物的生产效率。在厌氧条件W3110H菌株具有非常明显的积累琥珀酸的优势。进一步的研究证明ptsH的缺失能有效地改变PEP的代谢流量并积累琥珀酸。这一研究对于大肠杆菌厌氧发酵琥珀酸有重要的意义。（四）氧化还原平衡的优化。从好氧转到厌氧发酵琥珀酸的过程中，工程菌存在氧化还原不平衡的问题。我们通过敲除有氧琥珀酸生产中主要的两个NADH脱氢酶以驱动NDH-I成为有氧琥珀酸生产中NADH氧化的主要参与者。进一步厌氧阶段过表达ppsA基因通过ATP无效循环，降低厌氧阶段胞内ATP的产生，从而加快厌氧阶段葡萄糖消耗，使厌氧琥珀酸产量提高了59%。