中文摘要：

衔接蛋白Nck通过调节细胞骨架蛋白的成核作用，对细胞的形态和运动具有重要作用。申请者在前期工作中发现了一个新的Nck相互作用蛋白- - -Elmo1，且Elmo1在肝细胞癌（HCC）组织中的表达显著高于正常肝组织，在高转移肝癌细胞系中的表达也高于低转移和无转移能力的细胞提示Elmo1可能通过与Nck 的相互作用引起细胞骨架改变，促进肿瘤细胞的迁移。由于我们发现Elmo1结合于Nck的SH2结构域(酪氨酸磷酸化残基的结合区域)，本研究拟采用免疫共沉淀和GST-pulldown实验进一步验证Elmo1与Nck的相互作用，明确其相互作用是否依赖于Elmo1的磷酸化，并确定作用位点。最后，通过细胞和动物实验检测Elmo1 的表达变化对细胞迁移和肿瘤侵袭的影响，阐明Elmo1-Nck-WASP-Arp2/3这一新途径在调控细胞骨架系统，促进细胞运动中的作用，进一步揭示HCC侵袭、转移的分子机制。

结论摘要：

衔接蛋白Nck1对细胞的形态和运动具有重要作用。我们前期工作中发现Nck1相互作用蛋白Elmo1可能通过与Nck1的相互作用引起细胞骨架改变，促进肝癌细胞的迁移。本研究中，我们构建了组织芯片，对263对肝癌及癌旁组织进行免疫组化检测，发现Elmo1在肝癌组织中表达显著高于癌旁组织，Elmo1高表达的肝癌患者其1、3、5年总生存率和无瘤生存期均显著低于Elmo1低表达患者，Elmo1是肝癌患者预后不良的独立因素。继而我们在肝癌组织和肝癌细胞株SK-Hep-1中证实了肝癌体内、体外均存在有Elmo1和Nck1的相互作用。此外，我们采用免疫共沉淀方法证实肝癌组织较癌旁组织中的Elmo1酪氨酸磷酸化现象更为明显。继而对Elmo1质粒的Y18、Y216、Y395 三个磷酸化位点分别进行点突变，之后将上述质粒分别转染肝癌细胞SK-HEP-1，然后采用GST-Pulldown和免疫印迹对细胞中Elmo1和Nck1的相互作用进行验证，结果提示，上述3个位点对于两者的相互作用来讲都是必须的，突变后作用明显减弱。通过调控Elmo1表达发现，Elmo1能够通过激活Rac1调控肝癌细胞迁移能力；而Elmo1的酪氨酸磷酸化位点如果发生突变则上述功能缺失。此外，我们还证实了Nck1的SH2结构域的完整性对于Elmo1和Nck1相互作用至关重要，也直接影响到Elmo1诱导的Rac1活性增强和细胞迁移能力增强。再者，肝癌组织芯片免疫组化染色结果提示，Elmo1和上皮间质转化（EMT）标记物E-Cadherin和Vimentin及自噬相关标记物Beclin I和p62具有显著的相关性；细胞实验则提示Elmo1能够诱导肝癌细胞发生上皮间质转化，自噬细胞实验仍在进行中。此外，我们已经构建了Elmo1过表达和下调表达的慢病毒载体并获得了稳定表达的肝癌细胞株，正在对上述细胞株进行自噬和EMT芯片检测筛选关键通路蛋白，希望能够对其机制进行深入研究。总之，我们的研究结果显示，Elmo1促进了肝癌细胞的侵袭和转移，Elmo1是肝癌患者肝切除术后预后不良的独立因素，有可能成为肝癌基因治疗的潜在作用靶点。