中文摘要：

醇溶蛋白是禾本科作物种子中的主要贮藏蛋白质，其编码的基因是一个多拷贝的基因家族。虽然醇溶蛋白基因间的表达存在很大的差异，同时基因表达与DNA甲基化可能存在一定的关系，并直接受调控因子的调控。但是对基因表达差异的原因以及调控机理尚不清楚。本研究试图利用亚硫酸盐测序的方法，分析玉米中所有醇溶蛋白基因及其启动子的DNA甲基化，以便探讨醇溶蛋白基因家族的基因间的表达差异与DNA甲基化的关系；同时利用生物信息学方法鉴定醇溶蛋白基因启动子中新的结合模体，为鉴定和克隆新的调控基因提供理论依据；用农杆菌介导的RNA干扰（RNAi）技术，分别使调控醇溶蛋白基因的调控因子Opaque2、OHP和PBF基因沉默，探明各调控因子与相应的基因的关系，为改良玉米的种子营养品质以及种子安全贮藏提供有价值的信息。

结论摘要：

醇溶蛋白是禾本科作物种子中的主要贮藏蛋白质，其编码的基因是一个多拷贝的基因家族。之前的研究表明，不同玉米自交系中的醇溶蛋白基因的拷贝数存在差异，而且不同拷贝醇溶蛋白基因的表达存在很大的差异。在19-kDa的？-醇溶蛋白基因中，z1A2-1和z1B4各占A和B类型表达的90%左右，并且基因的表达受到组织培养的改变，表明基因表达与DNA甲基化存在一定的关系，但是对这种基因表达差异的原因以及调控机理尚不清楚。本研究利用亚硫酸盐测序的方法，对玉米中不同拷贝的醇溶蛋白基因的启动子及其基因本体的DNA甲基化进行分析。结果表明，19-kDa的醇溶蛋白基因启动子的高DNA甲基化是导致基因不表达或低表达的主要原因。而胚乳组织培养能改变DNA甲基化模式，进而影响基因的表达。在z1B基因中，组织培养使z1B1的启动子DNA甲基化水平降低而使其表达水平显著上升，而z1B4和z1B6的启动子DNA甲基化水平升高而使其表达水平显著下降。但z1A基因启动子DNA甲基化水平的改变对基因的表达几乎没有影响，表现出位点特异性。相比启动子而言，基因本体的DNA甲基化对基因表达的影响要小得多。高表达的z1A2-1和z1B4基因其本体的DNA甲基化都处于中等的水平（25-30%），而低或不表达的基因本体的DNA甲基化都过高或高低。另外醇溶蛋白基因主要受到转录因子Opaque2（O2）和PBF的调控，而O2与基因启动子中保守的模体序列结合。因此，利用生物信息学的方法，在玉米全基因组范围内搜寻潜在的调控基因，包括31个启动子中含有TCCACGTAGA模体序列和683个含有GATGAPyPuTGPu模体序列的基因，其中有12个基因在胚乳中特异性表达，包括8个醇溶蛋白基因。对玉米自交系W64A和CM105及其O2突变体进行表达谱测序，发现除了16-和18-kDa外，O2调控所有的醇溶蛋白基因的表达。构建转录因子O2、OHP和PBF转基因载体，用农杆菌介导的方法使相应基因的表达下调（或沉默），结果表明PBF只调控22-kDa和27-kDa醇溶蛋白基因的表达，而OHP特异性调控27-kDa醇溶蛋白基因的表达。醇溶蛋白基因的表达调控的研究结果，将为改良玉米的种子营养品质以及种子安全贮藏提供有价值的信息。