中文摘要：

提高体外成熟（IVM）卵母细胞质量，有效激活体细胞核移植（SCNT）卵母细胞，在辅助生殖、动物克隆或治疗性克隆领域具有重要意义。本课题组前期研究发现，骨髓间充质干细胞（MSC）条件培养液（CM）能够促进体外培养的小鼠卵母细胞/卵泡成熟，提高胚胎质量；并且能有效激活过暴露于CM的MII卵母细胞，具体机制尚未阐明。本研究拟采用卵泡膜干细胞（TSC）作为对照，进一步探讨干细胞微环境对卵母细胞发育、孤雌活化的调控作用，及其对SCNT卵母细胞的激活效率，并分析获得的胚胎干细胞（ESC）全能性；通过高分辨2-D电泳和图像分析寻找两种干细胞CM中蛋白斑点差异，蛋白质质谱技术鉴定，设计干预实验分析效应因子，从而探讨作用机制，旨在完善卵母细胞体外培养体系，寻求SCNT卵母细胞有效激活方法，拓宽ESC获取途径。

结论摘要：

提高体外成熟（in vitro maturation, IVM）卵母细胞质量，有效激活体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer, SCNT）卵母细胞，在辅助生殖、动物克隆或治疗性克隆领域具有重要意义。本课题组前期研究发现，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）条件培养液（conditioned medium, CM）能够促进体外培养的小鼠卵母细胞/卵泡成熟，提高胚胎质量；并且能有效激活过暴露于CM的MII卵母细胞，具体机制尚未阐明。本研究试图分析CM中的生物活性物质并阐明其作用机制。我们以卵泡膜干细胞（theca stem cells, TSC）作为参比细胞进行对比研究，结果显示TSC是定向干细胞，仅向卵泡膜细胞分化，而MSC则为多能干细胞。来自MSC和TSC的CM均可以促进GV期卵母细胞发育至MII期，且暴露CM 40min后诱发MII卵母细胞孤雌激活，但前者效率优于后者（P＜0.05）；囊胚形成率、ICM数量和ESC全能性两者无显著差异（P＞0.05）。为了进一步明确两种来源CM中生物活性因子差异及功能因子分析，我们通过2-D电泳和图像分析寻找两种CM中蛋白斑点差异，蛋白质质谱技术鉴定，设计干预实验分析效应因子。但是，2-D电泳结果显示存在高丰度蛋白干扰，通过分子筛滤过、切胶分析等手段仍无法有效去除干扰，shotgun质谱分析结果不满意。我们正在借助超滤、浓缩、层析等手段去除干扰蛋白。此外，我们通过磁珠分选、改进培养条件，分别从胎鼠和成年鼠卵巢组织内分离/原位标记，鉴定出生殖干细胞（Germline stem cells, GSC），解释了TSC培养过程中不断有卵母细胞排出是由于不合适的培养条件促进GSC分化，而非预存的卵母细胞，这与以往文献报道不一致。 通过该课题的研究，我们发现了一种较为理想的IVM体系和卵母细胞激活方法，拓宽了获取无伦理争议ESC的途径。得益于该课题资助，我们课题小组共发表论文16篇，其中SCI论文3篇，单篇IF最高5.212；申请并获得授权的发明专利4项；参加国内学术会议3次，国外学术会议1次；培养硕士研究生7名，其中5人顺利毕业。