中文摘要：

骨肉瘤是骨骼系统最常见恶性肿瘤，广泛切除结合新辅助化疗的治疗模式，约有40%的患者因复发及肺转移而治疗失败，因此，迫切需要探索新的诊治策略。肿瘤循环细胞(CTCs)是从实体肿瘤上脱落，然后进入血液循环的一种特异性细胞, 其能够抵抗细胞凋亡、保持细胞增殖能力及自我种植能力而具有更高复发转移潜能。初步研究表明，miRNA可作为CTCs的标记物。本课题拟富集分离并培养骨肉瘤CTCs细胞群，通过已建立的骨肉瘤血浆miRNA芯片表达谱,结合前期基因及蛋白组学研究成果，运用生物信息学技术检测鉴定骨肉瘤CTCs相关miRNA；获得CTCs特异miRNA、靶基因及相互作用蛋白质分子；最后通过调节CTCs的miRNA或靶点基因，观察体内外抑瘤及抗转移效果。本课题旨在探索血浆miRNA作为骨肉瘤CTCs检测的新标记物,通过选择性杀灭CTCs的分子靶向型治疗，从而控制复发及肺转移，解决困扰骨肉瘤的治疗难题。

结论摘要：

我们在国家自然科学基金的资助下: ①对20例骨肉瘤患者及20例正常人患者的混合血清进行了检测，完善了骨肉瘤血清miRNA差异表达图谱的构建，并运用qRT-PCR技术验证出部分miRNA在骨肉瘤患者血浆中异常表达，发现miR-29a，miR-29c，miR-31， miR-486、miR-483及miR-451等在 骨肉瘤患者血清中高表达，而let-7e，miR-21，miR-22，miR-23a，miR-424等在骨肉瘤患者血清中低表达。②成功建立了人骨肉瘤细胞株与人有生化成骨细胞株hFOB1.19的miRNA差异表达图谱。进一步通过骨肉瘤组织标本与正常组织标本的qPCR验证，明确了miR-10a，miR-20a，miR-17,miR-30b，miR-30d,miR-20b及miR-23b在骨肉瘤组织中高表达。而miR-100，miR-125b， miR-145，miR-193b，miR-221，miR-424，miR-542，miR-663在骨肉瘤细胞系中低表达。结合临床数据分析我们发现miR-23b,miR-30b/d的过表达与骨肉瘤患者的预后相关。在验证的基础上，我们对miR-30b/d的采用miRBase、 TargetScan 及miRanda常用数据库软件分别进行预测，发现NFKB，aha1等可作为其靶基因之一。我们同期通过iTRAQ筛查发现Aha1在骨肉瘤细胞中高表达，且与临床预后负相关，可作为骨肉瘤候选标志物。③通过CTC第二代纳米滤膜过滤技术，对50例骨肉瘤患者血液标本进行了循环肿瘤细胞（CTC）的分离与鉴定，在36例患者血液标本中鉴定出骨肉瘤CTC，其中26例患者中鉴定出循环肿瘤细胞簇（CTM），结合临床资料我们发现，初诊患者血液中，CTC以及CTM与临床预后相关。④骨肉瘤患者血清和骨肉瘤细胞共同低表达miRNA为miR-424，并对靶基因进行初步验证，发现eef1a2可作为其靶基因之一。我们同期通过iTRAQ筛查发现eEF1A2在骨肉瘤细胞中高表达，且与临床预后负相关，可作为骨肉瘤候选标志物。下一步拟从miRNA水平及下游靶基因eef1a2进行相关通路研究，阐明其相关机制，明确其靶向作用，为骨肉瘤的诊治提供新思路，此部分研究正在进行中。