中文摘要：

红曲霉是药食两用菌，越来越多地用于普通食品、保健食品和药品的生产。近年来发现它能产生一种对人畜有害的真菌毒素- - 桔青霉素，不仅使我国的红曲产品出口受到了损失，还严重地威胁到消费者的健康。为保证工业菌种的安全性，减少红曲霉有毒代谢产物对食品的污染，本项目拟构建高产桔青霉素的红曲霉的基因组cosmid文库，以与桔青霉素合成相关的抑制性消减杂交差异片段为探针，从文库中钓取与桔青霉素合成相关的候选基因，并对其进行序列测定，用生物信息学分析其开放读码框和调控区，以获得桔青霉素合成基因簇的信息，然后利用基因敲除技术对其中两个基因（CBS1、CBS2）分别进行功能分析和鉴定，从而确定桔青霉素生物合成基因，为阐述桔青霉素合成的可能代谢途径、构建或筛选不产毒的工业用菌和科学地评价菌种的生物安全性提供理论依据。

结论摘要：

本文通过包埋细胞核方法获得大片段DNA，采用随机剪切法回收40kb左右的DNA，与Fosmid载体连接，经包装、转染构建红曲菌的基因组Fosmid文库。采用PCR筛选混合池和打点杂交法从部分文库中筛选到了4个阳性克隆子，采用鸟枪测序法对其中的2个阳性克隆子进行序列测定，经生物信息学分析预测44kb DNA片段与桔霉素合成有关，采用基因敲除技术对基因簇上的3个基因进行了功能分析。主要结果如下1 构建了红曲菌Fosmid基因组文库,平均插入片段长度为36.6kb，预计文库的基因组覆盖倍数为27倍；2 筛选到与桔霉素合成相关的基因簇，预计大小为44kb，预测有16个开放阅读框；3 优化了红曲菌原生质体制备和再生条件，建立了红曲菌转化系统；4 构建了pksCT、ctnI 和ctnD 基因的置换型打靶载体pHD116、pACS-HPH 和 pGMC-HPH，筛选到了相应的基因缺失菌株，并分析其次级代谢产物的含量；5 推测 ctnI基因参与桔霉素和红曲色素合成代谢过程中4个酮基的聚酮链及十酰辅酶 A 的合成，ctnD 基因参与桔霉素和红曲色素的 PKS 后修饰过程，pksCT只与桔霉素合成有关。