中文摘要：

CNGC18在花粉萌发和花粉管生长中的功能和活性调控机制还不清楚。本研究首先采用电生理技术分别对cngc18拟南芥突变体和野生型花粉细胞以及异体表达CNGC18基因的HEK293细胞的内向质膜钙电流进行检测，研究CNGC18是否具有离子通道功能，并搞清其对钙和钾等阳离子的相对通透能力；研究CNGC18的离子通道活性是否受环核苷酸、微丝骨架和胞质pH的调控，揭示CNGC18的活性调控机制；采用在HEK293细胞中异体表达和双分子荧光互补技术相结合的方法，研究CNGC18功能蛋白包含单个还是多个蛋白亚基，之后通过蛋白提纯、交联和电泳等手段，揭示CNGC18功能蛋白的高级分子结构；最后，通过GFP标记和转基因，观察CNGC18蛋白从合成到插入花粉管顶端质膜的整个运动过程。本研究将阐明CNGC18的功能、调控机制、蛋白结构和运动规律，从分子到细胞，全面加深我们对花粉萌发和花粉管极性生长机制的理解。

结论摘要：

CNGC18是一个环核苷酸门控离子通道家族的成员，其突变导致拟南芥致死性的雄性不育表型，提示其在雄性生殖细胞中具有关键功能，并推测其为一种Ca2+通道。但其Ca2+通道的功能和活性调控机理还缺乏实验证据的支持。本项目拟研究CNGC18的蛋白功能，阐明其分子调控机理，以及其在花粉管极性生长中的作用和活性调控机理。因为CNGC18敲除突变体的致死表型，导致其纯合突变体无法存活，也因此无法用于关于CNGC18的研究。我们借助HEK293T异源表达体系，结合膜片钳技术，对其通道特性进行了详细的鉴定。研究结果显示，在异源表达CNGC18的HEK293T细胞中，我们记录到了典型的内向超极化激活的通道电流，而在对照组HEK293T细胞中仅能记录到微弱的背景电流信号。胞外Ca2+的移除则直接导致内向电流的消失，而细胞外Ca2+浓度升高或降低，则导致逆转电位向正电压方向或负电压方向移动。Ca2+通道抑制剂La3+和Gd3+均可以完全抑制该内向电流。这些结果清楚的表明，CNGC18是一种内向Ca2+通道。为了进一步鉴定其离子选择性，我们将胞外Ca2+换成相同浓度的Ba2+，我们在表达CNGC18的HEK293T细胞中记录到了类似的电流信号，电流幅度基本一致，而将胞外Ca2+换成K+,则记录不到任何电流信号，说明CNGC18对K+没有明显的通透能力。考虑到胞外存在超过100mM的NaCl，在胞外Ca2+或K+被移除的情况下，仅能记录到微弱的背景电流信号，说明CNGC18对Na+没有明显的通透能力。该结果表明，CNGC18对二价阳离子具有很强的通透能力，但在二价阳离子之间缺乏选择性；同时，CNGC18对Na+和K+没有明显的通透能力，表明其为二价阳离子选择性的内向二价阳离子通道。我们进一步研究发现，CNGC18可以被环核苷酸激活，且其功能蛋白是同源多聚体。该研究的实验结果已经在线发表在国际知名期刊Molecular Plant上。