中文摘要：

G蛋白偶联受体（GPCRs）是生物体内重要膜受体，通过激活三聚体G蛋白参与各种细胞外信号转导，已在人类药物开发中得到广泛的研究与应用。本项目以林果重要害虫舞毒蛾为对象，拟从以下几个方面鉴定杀虫剂新作用靶标GPCRs功能（1）舞毒蛾无参照全转录本测序分析；（2）生物信息学和文献分析鉴定出参与舞毒蛾重要生理功能的GPCRs基因；并分析克隆获得1～2条舞毒蛾重要生理功能GPCRs基因全长；（3）Real-time PCR分析杀虫剂对舞毒蛾重要生理功能GPCRs基因表达影响；（4）杀虫剂对昆虫细胞系Sf9体外表达GPCRs基因的影响；（5）转GPCRs基因果蝇对杀虫剂敏感性及对下游P450基因调控作用。本项目的研究将明确GPCRs基因如何成为杀虫剂新作用靶标，为分子修饰开发新杀虫剂提供思路和策略，并对于进一步开发基于细胞的高通量系统筛选有效杀虫剂具有重要意义。

结论摘要：

昆虫GPCRs参与重要的生理功能和内源、外源化合物的响应而受到广泛的关注，探讨GPCR超级家族重要基因功能对于明确昆虫生理和筛选新的杀虫剂作用靶标具有非常重要的意义。通过本项目的研究获得如下结果1、构建了亚洲型舞毒蛾幼虫转录组文库，获得了62,063条unigene基因；其中包括CarE、CYP、AChE、EcR、USP等杀虫剂作用靶标基因，并鉴定获得27个GPCR家族基因，克隆出眼白化病I型（LdOA1）和2条长寿基因（LdMth1和LdMth2）cDNA全长；2、利用实时荧光定量PCR技术分析了溴氰菊酯、甲萘威和氧化乐果对LdOA1、LdMth1和LdMth2基因表达影响，3种杀虫剂对GPCR基因主要表现为抑制作用；3、利用RNAi技术沉默舞毒蛾幼虫LdOA1和LdMth1基因，结果显示LdOA1和LdMth1基因沉默导致8d累计死亡率分别为50%和80%，6d体重显著低于对照ddH2O和GFP，同时影响幼虫营养利用从而作用于生长发育；4、将LdOA1基因构建到原核表达pGEX-4T-1载体中，在菌株E. coli Rosetta中以可溶蛋白形式成功表达；5、将LdOA1、LdMth1和LdMth2基因构建到果蝇表达载体pUAST-attB中，定点微注射入果蝇胚胎2#（25C）和3#（75B）染色体中，与ywr13s果蝇杂交，筛选出红眼表现型G1代果蝇，研究转GPCR基因果蝇对杀虫剂敏感性及对下游CYP家族基因表达调控。药膜法生物测定结果表明2#染色体表达LdOA1、LdMth1和LdMth2基因果蝇主要表现为对溴氰菊酯和辛硫磷杀虫剂敏感性增大，而3#染色体表达GPCR基因果蝇主要表现为敏感性减小。利用实时荧光定量RT-PCR技术分析2#和3#染色体表达LdOA1、LdMth1和LdMth2调控下游CYP家族基因表明，以杂交果蝇品系ywr13s为对照，3个GPCR基因调控CYP4e2下调表达，调控CYP6g1和CYP6a9上调表达；调控CYP6a2（除3#LdMth1）、CYP6a8（3#LdOA1）、CYP4ac3（2#LdMth1）和CYP6w1（2#LdMth1）也主要表现为上调表达。以上结果表明舞毒蛾G蛋白偶联受体参与了杀虫剂胁迫响应，将成为杀虫剂创制新的作用靶标。项目组成员通过三年的研究完成了课题研究内容，达到预期目标和预期成果。