构建诱导型乙醇酸氧化酶(GO)反义RNA和RNA干涉载体,转化拟南芥和水稻,筛选阳性植株,最终获得能稳定遗传的转基因植株。接着用不同浓度的诱导剂处理不同时间,以此定量抑制GO基因表达水平,然后检测植物生长表型性状、基因表达谱、H2O2、抗逆性等的变化,旨在深入阐明GO的生理功能及其作用机理。发掘GO新的生理功能,在功能基因组时代的生物学意义是显而易见的。此外,还可能由此深入了解光呼吸的功能及其与其它生理过程之间的关系。更有兴趣的是其蕴涵的实际意义了解GO在H2O2及草酸调控中的作用可能为研究植物抗逆性机理提供新的切入点;了解GO在光呼吸调节中作用可望为提高植物光合效率开辟新途径。
构建了水稻和拟南芥诱导型反义GO转基因材料,并且在水稻中比拟南芥具有更高的反义调控效果。因为诱导型反义技术可以适时定量调控目标基因表达,在水稻中尚未见有其它的报道,所以在材料创造方面取得了新的成绩。长期认为GO是植物中草酸合成的关键酶。我们通过测定草酸含量显著差异(1-12倍)的水稻叶片中的GO活性及对提纯GO催化特性分析等,发现差异叶片中的GO在转录、翻译、活性、催化动力学等水平均无明显差异。进一步用反义RNA技术成功地抑制了GO表达,使其活性降至野生型的10%以下,但草酸含量没有明显变化,有力地证明了乙醇酸氧化酶(GO)与水稻草酸积累调控无关。但在铵态氮下喂食乙醇酸可逆转草酸含量,表明草酸积累与内源乙醇酸含量仍然相关,意味着可能存在新的酶转化乙醇酸为草酸。确证GO为典型的光呼吸酶,排除以前的推论认为它有光呼吸途径以外必需功能;GO对光合、光呼吸具有严密的调节作用;GO调节光合作用很可能主要是通过乙醇酸大量积累造成的反馈抑制;反馈抑制的碳循环位点是Rubisco活化酶。