中文摘要：

自1990年起，牛布鲁氏菌病的发病率在我国逐年攀升，每年造成数十亿元的直接损失,预防该病的最佳方法是给牛接种疫苗。当前布鲁氏菌弱毒活疫苗存在安全性低、保护性能弱，且不能用血清学方法区分感染的动物是自然感染还是接种免疫。本项目通过定向改造布鲁氏菌弱毒活疫苗S19基因组的方法，用能增强T细胞免疫的外源基因，替换下布鲁氏菌弱毒活疫苗S19的毒力基因，同时让它具有正（血清学方法检测呈阳性）、负（血清学方法检测呈阴性）两个方向的分子标记功能，构建出具有自主知识产权，安全性能好，免疫保护性强，并且用血清学方法，就能区别感染的牛是野毒感染还是接种了分子标记疫苗的疫苗。

结论摘要：

自1990年起，动物布鲁氏菌病的发病率在我国逐年攀升，每年造成数十亿元的直接损失，防治该病的最佳方法是接种疫苗。当前布鲁氏菌弱毒活疫苗存在安全性低、保护性能弱，且不能用血清学方法鉴别感染的动物是自然感染还是接种免疫。本项目是通过定向改造布鲁氏菌弱毒活疫苗S19基因组的方法，构建基因突变的S19，以克服它的缺陷。 选择了靶基因，并对靶基因进行了研究。通过构建了VirB 12基因缺失株△VirB12株，对布鲁氏菌VirB12基因的毒力、免疫保护性进行了研究。结果表明△VirB12株与S19免疫保护性相当。表达纯化了VirB12蛋白，用纯化的VirB12蛋白能鉴别感染的小鼠是△VirB12感染还是S19株感染。 靶基因确定后，在前期构建的S19的Bp26基因缺失△Bp26株基础上，用能增强T细胞免疫活性的结核杆菌KD38基因代替△Bp26的毒力VirB12基因，构建成工程菌△Bp26-38株。通过检测感染小鼠的脾重量、细菌分离数、检测外周血液中的细胞因子、抗体的消减规律，结果表明△Bp26-38毒力都较亲本株较弱，安全性能好，引发的细胞免疫较亲本株S19高。表达并纯化了BP26、KD38、VirB12蛋白。并且能用纯化了BP26、VirB12蛋白做抗原，建立了鉴别感染的小鼠是工程菌株感染还是S19株感染区分开的负向方法。并且能用纯化的KD38蛋白做抗原，建立了把感染的小鼠是工程均株感染还是S19株感染区分开的正向方法。 构建了VirB5基因缺失株△VirB5株，能增强T细胞免疫活性的结核杆菌esat6基因代替S19的VirB5基因得基因突变株△V5-esat6。且能用纯化了VirB5蛋白做抗原，建立了感染的小鼠是工程均株感染还是S19株感染区分开的方法。同时，建立了用VirB5蛋白检测牛群布鲁氏菌病检测方法。 综上所述，本项目通过定向改造布鲁氏菌弱毒活疫苗S19基因组的方法，用能增强T细胞免疫的外源基因，替换布鲁氏菌弱毒活疫苗S19的毒力基因。同时让它具有正、负两个方向的分子标记功能，构建出了2株具有自主知识产权，安全性能好，免疫保护性强，并且用血清学方法，能区别感染的牛是野毒感染还是接种了分子标记疫苗的潜在布鲁氏菌疫苗，完成了基金项目所规定的任务。