中文摘要：

溶藻弧菌为我国特别是南方地区危害最严重的细菌性病原之一，前人的研究肯定了决定溶藻弧菌不同菌株间毒力差异的毒力基因存在于其毒力菌株的基因组中，但迄今还未确定溶藻弧菌的毒力基因及其致病机理。近年来，项目申请人确定了溶藻弧菌毒力菌株的9个特异基因片段，但还不能确定这9个基因片段的全长序列信息和这些基因在溶藻弧菌致病等生理过程中的具体功能，迄今为止，国内外也未见有关溶藻弧菌这些基因的研究报道。为此，本项目将采用SON-PCR钓取上述基因片段的全长基因，并利用pDM4自杀载体构建这些基因的缺失菌株，同时构建其功能互补菌株，研究这些菌株毒力强弱和主要毒力相关活性高低的变化，最终确定这些基因在溶藻弧菌毒力表现过程中的具体功能，为溶藻弧菌菌株分型和毒力菌株鉴定、揭示溶藻弧菌毒力基因和致病机理以及今后开展其基因缺失减毒活疫苗的研究奠定基础，具有重要的理论价值和应用前景。

结论摘要：

利用上个基金项目（编号30760190）确定的13条溶藻弧菌毒力菌株（可能）特异基因核心序列，成功获得10条含核心序列的全长基因。其中，c26包含ggdef，编码一个GGDEF 结构域蛋白；H76包含prs2，编码磷酸核糖焦磷酸合成酶；j2包含rcna，编码镍钴外排系统蛋白；j5包含未知功能基因；K35包含motB，编码MotB；m25包含met，编码多重药物外排转运子；n4序列包含vasC和vasd，分别编码VI 型分泌系统脂蛋白VasC 和VasD；t75序列包含mfp，编码一种膜融合蛋白。W90序列包含flp部分序列，编码III型分泌系统脂蛋白。f26序列中的核心序列不位于任何ORF中。利用重叠延伸PCR技术和双交换基因重组技术，成功构建了溶藻弧菌的基因缺失突变株ΔmotB、Δprs2、ΔvasD、ΔvasC和Δggdef。同时，构建了各菌株的互补菌株。各基因缺失突变株和野生株均在培养12h后达到对数生长期后期；与野生菌株相比，所有基因缺失菌株的泳动能力明显降低（P<0.01）；△motB和△vasC没有形成鞭毛，其他3个基因缺失菌株△prs2、△vasD、△ggdef和野生株的鞭毛形成正常；△vasD和△ggdef基本不形成生物膜，△vasC的生物膜的形成能力也明显减弱，△motB和△prs2与野生株的生物膜形成能力无显著性差异；在OD570时，△vasD、△ggdef和△vasC的生物膜吸光值明显小于野生株（P<0.01）；当注射菌液为4×106 CFU/ml和4×105 CFU/ml时，野生株、△prs2、△vasD、△vasC对凡纳滨对虾具有很强的毒性，均在注射菌液2-4h后开始死亡，在12-16小时内达到100%死亡率；与野生株相比，△motB和△ggdef不仅在死亡时间上较晚，而且死亡率也相对降低。互补菌株的表型与野生型的基本一致。因此，我们推测在溶藻弧菌中，motB基因参与了鞭毛的组装，与细菌的泳动能力有关；prs2基因与细菌泳动能力有关；vasD基因和vasC基因与生物膜形成以及泳动能力相关，而且vasC基因还可能参与了鞭毛的形成；ggdef基因与细菌的泳动、鞭毛形成以及生物膜形成能力有关。这些基因都可能直接或间接参与了溶藻弧菌的致病过程，为重要的毒力相关基因。这为今后系统揭示溶藻弧菌的致病机理奠定了良好基础。