中文摘要：

本项目采用双光子荧光（Two-Photon Fluorescence, TPF）和二次谐波(Second-Harmonic Generation, SHG) 非线性光学组合多模式成像及波谱技术，通过活体原位的3D无损监测，观察间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）移植裸鼠皮肤损伤模型后，对皮肤组织再生的作用机理。利用TPF成像技术观察EGFP标记的MSC的活动，MSC对血管新生的作用以及SHG成像技术监测MSC调控的胶原蛋白纤维，具像化地研究MSC在皮肤愈合中的作用机制包括MSC在皮肤伤口部位的活动、靶向移动方向，在新形成皮肤组织中的分布及分化；血管新生机理以及MSC对胶原蛋白纤维的产生及重建的影响。本项目将首次实现移植干细胞对皮肤再生的生理机理的3D活体在位研究，这也为研究干细胞对其它组织器官的再生作用机理提供方法学上的借鉴。

结论摘要：

该拟结题项目旨在利用先进的非线性光学成像方法—双光子荧光成像（TPF）和二次谐波成像（SHG）,研究移植间充值干细胞（MSC）对小鼠全皮层损伤皮肤伤口愈合的作用机理。拟考察伤口修复过程中MSC的活动、血管新生、上皮组织形成的完整性以及真皮层胶原蛋白纤维的再生。新型脱细胞支架的研制: 针对大面积的全皮层损伤(深入真皮层)，干细胞治疗面临的首要问题是细胞的植入。新兴生物技术支撑下的生物支架为干细胞提供了有效的植入方式。拟结题项目采用皮肤细胞外基质（ECM）经脱细胞制作的脱细胞支架（ADM)作为皮肤修复时MSC植入的生物支架，从而可利用SHG非线性光学显微成像技术活体、三维成像观察MSC在伤口愈合中的整体生物、物理效应。我们成功地实验制备了以胶原纤维生物材料作为干细胞定向、定点植入的支架，开启了项目开展的重要一步;并且发现该脱细胞支架的采用对伤口的愈合无论是促进血管新生还是对形成完整上皮组织均有明显效果。实现伤口修复过程的动态活体观察: 项目在活体小鼠损伤模型中利用TPF和SHG成像首次成功实现了三维、动态观察伤口修复过程中伤口及周边部位MSC的活动以及再生真皮层中胶原蛋白的产生过程。TPF和SHG光学成像技术的引入使活体动态观察皮肤创伤修复过程中MSC的活动及皮肤真皮层胶原蛋白再生成为可能，为皮肤创伤修复的机理性研究提供了一种非侵入性的、活体动态研究方法。研究脱细胞支架特性对完美皮肤重建的影响: 伤口完美重建的目标之一是无疤愈合。胚胎皮肤存在无疤愈合，但在成年皮肤中很难发生。皮肤细胞外基质ECM被认为在胚胎皮肤无疤愈合中起核心作用。项目因此深入研究ECM脱细胞形成的ADM支架特性对伤口无疤愈合的作用机理及效应，发现其生物机械特性—硬度对成年伤口的无疤愈合有明显影响。SHG三维成像显示了伤口愈合过程中再生真皮层中胶原蛋白纤维产生的形态、密度和方向以及形成的真皮层厚度，发现在两种硬度ADM作用下其变化模式完全不同在软的、接近胚胎皮肤的1天小鼠皮肤ECM制作的ADM支架作用下，再生的胶原在密度、方向性以及硬度上更接近正常皮肤组织。该研究为成年皮肤伤口无疤愈合的临床应用提供了一种潜在的生物医学材料。