中文摘要：

铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）能够特异性清除生物体内超氧阴离子自由基，在医药、食品和化妆品等领域有广泛的应用。然而Fe-SOD的热稳定性问题影响着它的使用范围和利用效率。不同来源的Fe-SOD热稳定性差别很大。本研究以原核生物的Fe-SOD作为研究对象，采用人工智能和模式识别的方法，从序列和结构层次剖析嗜热菌Fe-SOD中与热稳定性相关的特征序列和结构域；在此基础上，利用分子进化技术设计常温菌Fe-SOD的突变体以增加热稳定性；并采用分子动力学模拟计算突变体的相变温度，从而筛选出显著提高常温Fe-SOD热稳定性的突变；通过分子克隆技术表达并提取Fe-SOD，测定、比较活性和稳定性，解析嗜热Fe-SOD的耐热机制。本项目将为阐明常温Fe-SOD与嗜热Fe-SOD之间的分子进化规律提供理论依据，为蛋白质工程提高常温酶耐热性提供有效途经。

结论摘要：

嗜热酶作为生物催化剂具有可以加快动力学反应，降低能耗，减少污染等优势。 Fe-SOD酶能够特异性消除生物体内的超氧阴离子自由基，在医药、食品和化妆品等领域有着广泛的应用。然而Fe-SOD酶的热稳定性问题影响了它的使用范围和利用效率。本项目在构建了原核生物Fe-SOD酶数据集的基础上，计算了氨基酸组成、二肽含量、二级结构特征、氢键、盐桥、溶剂接触表面积、紧密度、空腔数目和体积、温度因子等Fe-SOD酶的不同层次结构参数，并通过主成分分析法、决策树算法，支持向量机算法和K最近邻算法分析了这些结构参数之间的关系以及筛选出了与耐热性相关的因素。研究发现，暴露面积，氢键和二级结构的相互作用对Fe-SOD酶抵御高温起到至关重要的作用。带电荷残基在形成盐桥时，不同带电荷残基的参与形成盐桥的比例是不同的，耐热Fe-SOD酶的带电荷残基在形成盐桥方面具有很强的倾向性。带负电荷的Arg和带正电荷的Glu形成盐桥的效率很高。IFFS特征选择算法结合决策树算法，KNN算法和支持向量机算法对耐热蛋白质和常温蛋白质进行分类预测后发现单个氨基酸以及它所在的微环境是蛋白质耐热的序列基础。与此同时，从Fe-SOD酶结构柔性来看，极端微生物产生的Fe-SOD酶比常温Fe-SOD酶具有更高的柔性。接下来利用Voronoi算法计算空腔个数和包装密度进而分析Fe-SOD酶与水分子之间的相互作用。很明显的，嗜热Fe-SOD酶和嗜冷Fe-SOD酶采用通过填充空腔来增加范德华相互作用力的方式来抵御恶劣的环境。进一步通过分子进化设计了两个MtSOD的突变体，利用分子动力学模拟研究了野生型Fe-SOD酶和突变体的结构参数随温度变化的趋势。对均方根偏差，溶剂接触表面积，空腔个数，包装密度，定容热容的分析不仅说明了突变体具有更高的耐热性，也说明了利用模式识别、机器学习以及分子动力学模拟的手段从理论上分析决定Fe-SOD酶耐热性的序列和结构特征是可行的。尤其是利用分子动力学模拟的方法计算定容热容，可以定量的确定酶的热稳定性，这不仅对于研究Fe-SOD酶有很好的指导作用，也为研究其他类型酶的热稳定性问题奠定理论基础。在本项目的执行过程中，共发表论文14篇，其中SCI论文4篇；到伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校和纽约大学分别就分子进化和计算化学进行了学术交流；培养博士研究生3名，硕士研究生4名。