中文摘要：

沙门氏菌Ⅲ型分泌系统分泌的效应分子SopB在沙门氏菌感染宿主细胞初期和后期具有不同的亚细胞定位并发挥不同的功能，SopB实现其亚细胞定位以及功能调节的关键是SopB能够利用宿主细胞的未知机制进行泛素化修饰，而目前此机制尚未阐明。本课题组建立了通过酶促反应检测SopB泛素化修饰的体外活性重组方法，并以此方法为纯化依据在人上皮细胞裂解液中纯化到了泛素化修饰SopB的候选泛素连接酶TRAF2。我们拟采用体外酶促反应、RNAi、traf2-/- MEF细胞以及免疫荧光双重染色激光共聚焦等技术，从体外-体内两个方面对TRAF2泛素化修饰SopB的功能进行研究，并进一步分析TRAF2是否参与了SopB介导的宿主细胞Akt、iNOS以及MAPK的激活。该研究揭示了沙门氏菌进化了能够利用宿主细胞特有的机制为其成功侵染服务的致病机理，指出了一个可能适用于其他致病菌的新范例，有望成为新的沙门氏菌治疗靶点。

结论摘要：

SopB是由沙门氏菌SPI-1 Ⅲ型分泌系统分泌的一种由561个氨基酸构成的蛋白质分子, 是一种肌醇磷脂酶。沙门氏菌感染细胞后，SopB的功能在时间和空间上实现精确调控的关键是SopB在感染宿主细胞的过程中发生了泛素化修饰。本课题的研究内容是在人肠上皮细胞中分离、纯化和鉴定能够泛素化修饰沙门氏菌效应蛋白SopB的泛素连接酶。众所周知，泛素化反应体系是由E1、E2和E3三种酶催化的级联反应，本课题原创性的构建了能够通过酶促反应检测SopB泛素化修饰的体外活性重组方法，在人肠上皮细胞裂解液中依次通过硫酸铵分级沉淀、疏水层析、离子交换层析的方法分离纯化到能够泛素化修饰SopB的泛素连接酶，接下来利用串联质谱（MALDI-TOF-TOF）对纯化的酶蛋白进行序列分析和鉴定，发现该泛素连接酶为TRAF6。进一步从体外（In Vitro）以及体内（In Vivo）两个方面对该泛素连接酶TRAF6泛素化修饰SopB的功能进行验证。结果发现，TRAF6能够在体外催化SopB的泛素化，并具有浓度依赖性。同时TRAF6能够催化SopB的多位点单泛素化，这与前人发现的SopB泛素化修饰的类型相一致。同时，本课题以TRAF6缺失的鼠胚胎成纤维细胞（Traf6-/-）作为体内实验模型，比较了沙门氏菌分别感染野生型鼠胚胎成纤维细胞Traf6+/+和Traf6-/-后，SopB的泛素化修饰情况。结果表明，与野生型细胞相比，TRAF6的缺失（Traf6-/-）显著抑制了SopB的泛素化修饰。然而，当在Traf6-/-细胞中异位表达TRAF6野生型蛋白后，重新恢复了SopB的泛素化修饰现象。而在Traf6-/-细胞中异位表达TRAF6活性缺失突变体C70A后，未能恢复SopB的泛素化修饰，表明TRAF6对SopB的修饰依赖其RING泛素连接酶催化结构域。本研究发现UbcH5c为沙门氏菌感染过程中与TRAF6配对催化SopB泛素化修饰的泛素结合酶E2。本研究的科学意义是发现沙门氏菌进化了能够利用宿主细胞特有的生物化学机制为其成功侵染服务的致病机制，指出了一个可能适用于其它致病菌的新范例，并为沙门氏菌病的治疗提供了一个新的靶点。