中文摘要：

钙调蛋白(CaM)通过与靶蛋白相互作用来发挥调节功能，而CaM在癫痫中对电压门控性钠通道的调节作用的改变，特别是其对钠通道电生理功能的影响对于揭示癫痫神经细胞膜兴奋性机制具有极其重要的意义。课题组前期工作发现自发性癫痫大鼠(SER)钠通道定位与表达均有异常，推测是与相关蛋白相互作用的结果。我们率先认为CaM是与SER脑海马钠通道相互作用的重要结合蛋白，CaM通过与钠通道结合来影响通道门控动力学，改变细胞膜兴奋性，最终导致SER癫痫表型的发生。因此，本研究拟通过1、膜片钳方法研究CaM及其突变体对癫痫钠通道电生理功能的调节作用； 2、免疫荧光与免疫印迹的方法研究癫痫钠通道与CaM的共定位与表达情况；3、免疫共沉淀方法研究癫痫中CaM与钠通道的相互作用，进一步揭示癫痫发病机制，进而为利用 SER来筛选钠通道特异性亚型与CaM结构特异性抗癫痫药物靶点提供更有价值的理论依据。

结论摘要：

电压门控性钠通道（VGSC）的表达与功能与癫痫发病机制密切相关。本研究中我们首先检测了自发性癫痫大鼠（SER）以及震颤鼠（TRM）以及无镁癫痫细胞模型中的VGSC亚型NaV1.1，NaV1.2，NaV1.3，NaV1.6，钙调蛋白（CaM）和钙调蛋白激酶II（CaMKII）在海马和皮质蛋白的表达与定位情况。免疫印迹技术发现与正常Wistar大鼠相比，SER与TRM 海马中VGSC亚型以及CaM蛋白表达均上调，而CaMKII水平下降。SER与TRM 皮质中的目的蛋白表达水平与海马正好相反，可能是皮质代偿海马变化的结果。无镁模型组中NaV1.1，NaV1.2和NaV1.3蛋白表达均上调，CaM表达不变，而CaMKII水平下降。免疫荧光双标结果显示与正常大鼠相比，SER和TRM VGSC亚型和CaM在海马CA1，CA3和DG区共定位的阳性细胞数明显增加，但皮质区的共定位阳性细胞数减少。与正常神经元相比，无镁模型中 NaV1.1，NaV1.2，NaV1.3和CaM共定位的阳性细胞数明显增加。应用全细胞记录模式检测无镁癫痫细胞模型VGSC短暂快速失活钠电流 (INa,T)的电生理功能变化。无镁细胞中不同膜电位下的INa,T平均电流密度显著增高，但I-V曲线的形状无明显变化。与对照组相比，无镁组的INa,T激活曲线向超级化方向移动；无镁组的INa,T失活曲线基本没有变化。应用单通道记录模式发现无镁癫痫细胞模型中VGSC延迟缓慢失活钠电流 (INa,P) 通道活性比正常组显著增高。与正常细胞相比，无镁模型中INa,P 单通道平均电流幅度、单通道电导和通道开放时间没有显著变化。我们进一步研究CaM对癫痫中钠通道活性的调节作用。通过膜片钳单通道记录模式发现，CaM对正常神经元和无镁模型通道活性的调节存在浓度依赖性，其曲线为经典的S形。与正常神经元相比，无镁模型对CaM、CaM12和CaM34调节更加敏感，而对于CaM1234的调节不是十分敏感，说明N环和C环需要与钙离子结合才能负责无镁癫痫模型神经元中钠通道的调节作用。本研究从浓度依赖性和钙离子依赖性两方面系统阐明CaM对癫痫中VGSC的调节作用。我们率先提出钙调蛋白调节癫痫钠通道新机制CaM可能通过更多地聚集在细胞膜或者表达上调，更多地结合相应钠通道位点，进而引起VGSC活性的增加，最终导致癫痫的产生和发展。