中文摘要：

脑血管病是我国第一大致死疾病，多为缺血性脑卒中。临床虽有多种治疗手段，结果却并不令人满意。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）可促进血管生成，保护神经元，动员内源性神经干细胞，具有较好的应用价值。但bFGF静脉给药半衰期短，难以透过血脑屏障，全身不良反应多。通过基因治疗在局部表达bFGF可克服静脉给药的不足，但常规基因治疗载体目的基因表达不具可调控性，长期过表达bFGF存在致瘤的风险。我们前期成功构建低氧诱导bFGF表达腺病毒载体，有效解决这一难题。但病毒载体在脑组织中扩散范围有限，治疗作用难以充分发挥。神经干细胞因免疫源性低、可在脑组织中定向迁移、能被诱导分化为神经元，是理想的基因治疗载体。本课题拟构建低氧诱导bFGF基因修饰神经干细胞，移植于大鼠大脑中动脉永久性闭塞模型(pMCAO）脑缺血半影区，通过神经功能缺损评分和脑梗塞面积测量等考察其神经保护作用，将为缺血性脑卒中治疗提供新的思路。

结论摘要：

缺血性脑卒中等脑组织损伤释放大量兴奋性神经递质与氧自由基等，不利于移植神经干细胞的存活，且最终仅有极少部分能分化为神经元。而碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能显著促进神经干细胞的迁移、增殖与分化。利用缺血性脑卒中局部脑组织中的缺血缺氧微环境，本课题组探索低氧调控性bFGF基因治疗联合神经干细胞移植治疗缺血性脑卒中的新思路。采用Invitrogen公司的无启动子慢病毒包装系统，通过多步骤基因重组，成功构建携带基因表达调控元件5HRE-bFGF的重组慢病毒载体，将其与慢病毒包装质粒混合物共转染293T细胞，成功包装并获得重组慢病毒颗粒。重组慢病毒侵染C17.2神经干细胞后，通过杀稻瘟菌素淘汰筛选获得被重组慢病毒感染的细胞。通过梯度稀释法，获得一系列基因修饰神经干细胞单克隆，进一步通过免疫印迹法，从中筛选常氧情况下几乎不表达bFGF，而在低氧环境下bFGF表达显著上调的单克隆神经干细胞。线栓法成功制备大鼠大脑中动脉缺血/再灌注损伤模型（MCAO），造模后24h，通过尾静脉注射将bFGF基因修饰神经干细胞静脉移植入MCAO大鼠体内，神经功能缺损评分结果表明bFGF基因修饰组神经功能恢复显著优于对照组hrGFP基因修饰组。TTC染色结果显示bFGF基因修饰组与hrGFP基因修饰组之间脑梗死面积无显著性差异。CM-DiI标记荧光检测结果表明，与hrGFP基因修饰组相比，bFGF基因修饰显著增加了缺血损伤区中移植神经干细胞的数量，提示bFGF可促进移植神经干细胞在MCAO大鼠缺血缺氧脑组织中的存活、迁移与增殖。免疫荧光检测结果显示仅有极少hrGFP基因修饰神经干细胞分化为神经元（NeuN），多数仍维持神经干细胞特性（Nestin）；而bFGF基因修饰神经干细胞分化为神经元的比例显著增加。但分化为星形胶质细胞（GFAP）的比例，二组之间无显著性差异。将bFGF基因修饰神经干细胞移植于大鼠MCAO同侧脑室，获得较静脉移植更优的神经功能改善。然而，bFGF基因修饰神经干细胞移植促进MCAO大鼠神经功能改善的最佳细胞数量、移植时间、移植途径仍需后续进一步优化确定，且bFGF基因修饰神经干细胞移植后的长期治疗作用，以及是否存在向肿瘤细胞的恶性转化仍有待进一步研究。项目实施以来，发表SCI论文1篇，已投稿SCI论文1篇，另一篇SCI论文正在撰写中，培养硕士研究生2名。