中文摘要：

克氏梭菌是研究能量代谢的模式菌株，因具有发酵乙醇和乙酸的独特能力和具有与产丁醇及产氢梭菌类似的生化途径而备受关注。其基因组已被测序，生化途径及关键酶已被详细研究，但代谢调控知之甚少。申请人前期已纯化表达了能量代谢关键酶NADH依赖的ferredoxin:NADP+氧化还原酶（NfnAB），发现在crt1-nfnAB基因簇上游存在编码可能为全球调控蛋白的氧化还原感应转录阻遏蛋白Rex的ORF，RT-PCR和Northern blot分析发现它与crt1-nfnAB共转录，并据已有信息建立了发酵乙醇和乙酸代谢调控的初步模型。本项目拟在前期工作基础上，研究Rex感应氧化还原状态（NADH/NAD+比率）的机制，构建rex缺失突变株，在转录组和蛋白组水平上系统研究不同氧化还原状态下Rex对克氏梭菌能量代谢的调控。该研究有助于深入理解梭菌生理生化过程，为发酵制氢和产丁醇及代谢工程改造提供理论依据。

结论摘要：

克氏梭菌因具有发酵乙醇和乙酸的独特能力备受关注。它在发酵制氢和制沼气的菌群中具有较高的丰度，是所谓 “羧酸平台”的主要菌株，研究其生理机制对生物能源和废物资源化利用以及环境碳循环具有重要的意义。在已知其基因组序列和关键生化途径的基础上，本项目从其代谢调控出发开展研究，尤其是胞内氧化还原状态对发酵过程的影响，着重关注氧化还原对代谢的调控作用。我们发现在能量代谢关键酶ferredoxin依赖的转氢酶（NfnAB）和丁酸合成相关酶基因簇crt1-bcd1-etfA1B1-hbd1-nfnAB上游存在编码氧化还原感应转录阻遏蛋白Rex的ORF，经RT-PCR和Northern blot分析发现rex与crt1-bcd1-etfA1B1-hbd1-nfnAB共转录，并在crt1的启动子区域发现了Rex蛋白的结合序列。进一步通过生物信息学预测，发现在831个基因（簇）的启动子区有Rex蛋白特异结合位点，包括电子转移和能量代谢、中心碳代谢如乙醇氧化、丁酸等脂肪酸合成和丁醇合成和转录调控蛋白如lysR等相关基因，推测Rex为全球转录调控蛋白。凝胶阻滞实验（EMSA）和等温滴定量热法（ITC）进一步验证了Rex与这些基因启动子区域的的相互作用以及NAD+/NADH的影响。为深入研究胞内Rex的调控机理，我们尝试敲除rex基因，然而经过两年的尝试均没成功。因Rex通过感应胞内NAD+/NADH比率来发挥调控，我们发现克氏梭菌生长前后期NAD+/NADH比率分别为1.4和24.9，故我们测定了这两个时期的转录组以期分析Rex的调控作用。结果显示，乙醇氧化、CO2固定、脂肪酸合成和丁醇合成的相关基因在前后期均大量表达，在后期表达量更高，而个别基因则前期表达较高，其中部分酶编码基因的转录直接受Rex调控，如异柠檬酸脱氢酶（idh），NAD+合成酶（nadE）、NAD+依赖的丁醇脱氢酶（bdh2）、双功能醛醇脱氢酶（aad）、双功能的CO2脱氢酶和乙酰CoA合酶（acs/codh）等。鉴于长链脂肪酸和醇类化合物的重要用途，我们调查了克氏梭菌发酵液中这两类化合物的种类，发现该菌可合成C5–C8脂肪酸及丁醇和己醇，经过对关键酶的异源表达和生化分析，结合转录组分析结果，我们提出了这两类发酵产物的合成路径。本研究为发酵产中长链脂肪酸和醇类化合物提供了详尽的生理依据。