中文摘要：

本项目以模式生物斑马鱼为材，以外源报告基因及5－8个功能已知的斑马鱼内源基因为靶基因，分别选1－2个靶位点，设计正反义引物，与U6启动子相连后，克隆至T载体－此即siRNA表达质粒。将表达siRNA的质粒显微注射至斑马鱼早期胚胎，追踪观察胚胎发育，结合原位杂交及切片等方法，探索载体介导的siRNA在斑马鱼胚体中是否具有特异抑制靶基因表达的作用。在此基础上，进一步研究不同靶位点的选择（每个基因选6－8个靶位点）与siRNA干扰效果的关系；并用siRNA技术研究4－6个斑马鱼新基因的功能。目的是在斑马鱼系统中建立快速方便鉴定基因功能的技术途径，为大规模开展基因功能研究奠定基础。

结论摘要：

RNA干扰是指通过导入一段与内源基因同源的双链RNA序列（dsRNA），使内源mRNA降解，从而导致转录后的基因沉默。RNA干扰广泛存在于细菌、植物和动物中。脊椎动物中，长链dsRNA能引发干扰素反应而引起非特异性的mRNA降解，而21－23nt长度的siRNA能特异性介导基因的沉默，因而被广泛应用于基因功能研究。目前斑马鱼siRNA干扰方面的报道极少。本文中，我们开展了U6启动子驱动的siRNA介导的斑马鱼RNA干扰研究。选择功能明确且与表型相关的数个斑马鱼内源基因和GFP报告基因为靶基因，分别选2－4个靶位点，构建U6启动子驱动的siRNA表达载体，显微注射至斑马鱼受精卵，追踪观察胚胎发育。根据表型分析结合整胚原位杂交结果，探测siRNA对斑马鱼体内基因表达的影响。并用siRNA技术研究新基因的功能。结果表明1.）U6启动子驱动的siRNA能抑制斑马鱼靶基因的表达，但抑制作用不完全。2.) 针对不同的靶位点，siRNA介导的干扰效果有差异。3.)斑马鱼中siRNA介导的RNA干扰存在非特异性-脱靶效应，原因尚待进一步探索。