中文摘要：

亚硝酸盐在水产养殖中是诱发暴发性疾病的重要环境因子！我们的前期研究工作表明，亚硝酸盐应激能诱导对虾血细胞凋亡率升高。细胞凋亡可能是对虾应对环境胁迫的一种保护性策略。本项目以南方广泛养殖的凡纳滨对虾为研究对象，首先探明亚硝酸盐胁迫下对虾细胞凋亡发生的规律，确定引起细胞凋亡发生改变的关键亚硝酸盐浓度和胁迫时间；在此基础上，运用双向电泳分析亚硝酸盐应激前后对虾的蛋白质差异，筛选与细胞凋亡相关的差异蛋白进行质谱分析和生物信息学分析；最后，本研究拟进一步借助抑制性消减杂交技术，构建凡纳滨对虾在亚硝酸盐应激前后的差异表达基因消减文库，并筛选克隆出与细胞凋亡紧密相关的基因，进行功能分析，明确它们在调控机体细胞凋亡中的作用。本研究从生产实际中选题，研究成果对于虾类的健康养殖具有深远的现实意义；本项目初步揭示亚硝酸盐应激诱导凡纳滨对虾细胞凋亡的调控机理，这对深入研究甲壳动物防御的分子机理具有重要的理论意义。

结论摘要：

亚硝酸盐是细菌硝化作用和生态系统中脱氮作用过程的中间产物。通常情况下，生态系统中细菌硝化作用和反硝化作用处于一个动态平衡状态。 然而， 随着水产动物集约化养殖的发展，水质污染加剧，环境中亚硝酸盐的含量不断上升，成为水产养殖中诱发爆发性疾病的重要环境因子。以往由于研究技术限制等原因，关于亚硝酸盐对水产动物毒性作用的研究多数停留在半致死浓度，以及对生理生化代谢和免疫功能的影响等方面， 其具体应激作用机制仍有待深入研究。 本研究首先利用流式细胞术检测了亚硝酸盐应激下凡纳滨对虾血细胞中的一氧化氮含量、活性氧含量、酯酶活力和细胞凋亡率，然后检测了血细胞中凋亡相关基因、抗氧化酶系统和抗应激基因mRNA水平的变化，发现凡纳滨对虾启动了抗氧化酶系统和抗应激基因来应对亚硝酸盐应激造成的氧化损伤。以此为基础，我们优化以对虾肝胰腺为材料的蛋白质双向电泳技术，分析凡纳滨对虾在亚硝酸盐胁迫前后的蛋白质差异，鉴定出了33个差异蛋白点，对差异蛋白点进行质谱鉴定以后发现，亚硝盐应激显著影响了免疫、凋亡、抗氧化酶、解毒相关蛋白的表达水平。然后，我们利用Illumina测序技术构建了亚硝酸盐应激下凡纳滨对虾的转录组文库，获得了平均长度为561 bp的Unigenes42,336条，用NCBI蛋白质数据库（Nr），非冗余核苷酸数据库，基因本体论（GO），直系同源基因簇（COG）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库做参考，共注释了23,532条Unigenes，揭示了凡纳滨对虾转录组丰富的信息。基于获得的转录组数据，我们构建了凡纳滨对虾在亚硝酸盐胁迫前后的数字基因表达谱，共发现1922个差异表达的基因，这些差异性表达基因对亚硝酸盐处理后的反应是一个整体调控网络。为了了解这些基因在机体应对环境胁迫中的作用，我们对KEGG的多条通路进行了综合分析，发现亚硝酸盐应激48 h后，不仅导致了免疫相关基因的变化，同时也诱发了外源物质的降解与代谢、DNA复制和修复相关基因的变化。本研究初步构建了亚硝酸盐应激下凡纳滨对虾的细胞和分子响应调控网络。研究成果进一步扩展了甲壳动物的基因库，为探索新基因的序列和功能提供了有效的信息， 为深入研究亚硝酸盐对凡纳滨对虾毒性效应的分子机制以及对虾抗胁迫防御机理奠定了基础。对于提高对虾抗环境胁迫和抗病原感染的能力、降低亚硝酸盐的危害，促进虾类的健康养殖具有重要的现实意义。