在前期工作的基础上,依据肾主骨、生髓、通脑的中医理论,利用神经发育基因BMP深入研究高效获取MSC转分化为神经组织工程新型种子细胞;并与含有龟板有效成分的三维高分子材料联合三维培养,构建神经组织工程; 将其移植至脊髓全横断损伤区,应用神经解剖的束路逆行荧光追踪、免疫组化及原位杂交等技术研究其增殖与神经分化, 脊髓前角运动神经元、大脑运动皮质的BMP表达和分布,神经功能评估,为临床从根本上解决脊髓全横断损伤的修复提供了广阔的前景;应用干细胞与中药和高分子材料构建神经组织工程的研究是组织工程一个崭新的研究领域,具有极其重要的理论意义和巨大的社会需求与市场价值。
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是目前研究最多、应用潜力最大的干细胞之一。将龟板用递增极性溶剂分步提取,所得石油醚部位,乙酸乙酯部位,乙醇部位和水溶性部位提取物进行MSC的增殖试验,GC-MS and HPLC确定龟板促MSC增殖成分含有脂肪酸类、脂肪酸酯类和甾类。龟板可能通过BMP4来调控MSCs的增殖。 MSC分别接种于龟板血清壳聚糖组、对照血清壳聚糖组和壳聚糖组,应用光镜和扫描电镜观察MSC在壳聚糖上三维培养的生长,MTT法测定MSC在壳聚糖粘附和生长增殖及细胞毒性。表明龟板血清无影响材料物理特性;但龟板血清以量效依赖方式促进MSC在壳聚糖膜粘附、生长和增殖。将标记有5-溴脱氧尿嘧啶Brdu的MSCs分别植入脊髓损伤体内和龟板治疗脊髓损伤体内。于移植后取损伤脊髓组织,用Brdu、神经丝蛋白NF、胶质纤维酸性蛋白GFAP免疫组化及Brdu/NF和Brdu/GFAP双标染色检测移植后MSCs的存活和分化。结果发现, 益肾龟板能促进脊髓损伤移植MSCs存活和分化为神经元。