中文摘要：

乳酸脱氢酶C4基因（LDHC基因）在正常男性呈精子特异性表达，其产物- - 乳酸脱氢酶C4（LDH-C4）在精子的能量代谢、获能过程以及精卵结合中起重要作用。本研究拟利用LDH-C4特异性底物- - α-羟基戊酸在不明原因男性不育症患者中筛选出精子LDH-C4活性低下者，从中检测出LDHC基因突变。通过对LDH-C4的生物信息学分析、LDH-C4突变体的表达，研究基因突变对乳酸脱氢酶C4结构、功能和活性的影响。通过计算机辅助的精液分析、体外受精试验和精子获能试验（蛋白酪氨酸磷酸化测定），研究基因突变对精子活力、活动性和功能的影响。通过精子ATP和乳酸含量的测定，研究LDHC基因突变导致男性不育的生化机制。本研究将在国际上首次证实LDH-C4基因突变是导致男性不育的部分遗传因素，为男性不育症提供新的病因学解释。

结论摘要：

乳酸脱氢酶 C4（LDH-C4）在精子的能量代谢、获能过程以及精卵结合中起重要作用。本课题采用以 α-羟基戊酸为LDH-C4 特异性底物检测精子 LDH-C4 活性的染色方法，筛选出精子 LDH-C4活性降低的特发性不育患者进行 LDHC基因突变检测，共检测到2个突变位点，经T克隆鉴定碱基改变分别位于LDHC基因第5外显子的第40（T→G）和115（T→A）位，均呈杂合状态，命名为L153X和L178X。课题采用分子克隆、基因定点诱变等技术，构建并获得了野生型 LDH-C4及其突变体的原核、真核重组载体。通过诱导表达和转染 HeLa/293T细胞，模拟纯合、杂合突变对LDH-C4 活性的影响。另一方面通过生物信息学分析，对LDH-C4及其突变体的蛋白二级~四级结构、模序、蛋白功能等进行预测。通过精子包浆ATP测定、计算机辅助的精液分析及精子获能等实验，研究了LDHC基因突变对精子功能的影响。通过免疫共沉淀、激光共聚焦荧光定位及非变性PAGE结合α-羟基戊酸染色，研究了野生型和突变型C亚基间的相互作用，深入探讨了LDHC基因突变导致男性不育的致病机制。结果显示（1）纯合和杂合突变可导致 LDH-C4 活性的丧失或降低；（2）LDHC突变体丧失了多个氨基酸残基以及酶活性位点和底物结合位点，不能自发同源聚合形成具有催化活性的四聚体；（3）含LDHC突变的精子存在能量代谢异常和获能障碍；（4）野生型C亚和突变型C亚基/多肽间存在相互结合作用，并可能进一步影响LDH-C4四聚体的聚合和/或蛋白结构而最终导致LDH-C4蛋白催化活性异常。课题在国际上首次证实了 LDH-C4 基因突变是导致男性不育的部分遗传因素，并从遗传学、分子生物学、生物化学和病理生理学等层面探讨了其导致男性不育的机制。