中文摘要：

视神经损伤后视网膜神经节细胞（RGCs）死亡、轴突溃变是视功能损伤的病理基础。前期研究观察到损伤可诱导内源性α晶状体蛋白表达增加，表达的α晶状体蛋白主要分布于RGCs膜，通过抑制caspase-3活化，减缓RGCs凋亡，但对其作用途径和机理不明。有文献提出细胞膜受体PAR-2可与α晶状体蛋白结合并表达于星形胶质细胞膜，PAR-2活化对α晶状体蛋白抗细胞凋亡效应具有协同作用。由此，本项目拟利用离体和在体模型观察α晶状体蛋白与膜受体PAR-2在RGCs中的表达与定位；采用免疫共沉淀和特异基因片段结合筛选，明确α晶状体蛋白和PAR-2的相互作用关系，提出α晶状体蛋白在调节PAR-2活性中的意义；揭示PAR-2在α晶状体蛋白介导的抗RGCs凋亡中的作用；从而提出α晶状体蛋白促RGCs损伤修复中的机制，本项目是课题组前期工作的继续和深入，为探索治疗视神经损伤的新策略奠定基础。

结论摘要：

目的本研究拟利用在体和离体损伤模型观察膜受体PAR-2在RGCs中的表达与功能；明确α晶状体蛋白与PAR-2的相互作用关系，从分子水平上求证α晶状体蛋白是否通过促进PAR-2活化，发挥了胞内抗细胞凋亡的作用，为探索治疗视神经损伤的新策略奠定理论基础。方法①建立Long Evans大鼠视神经钳夹伤在体模型，行视网膜冰冻切片，采用免疫荧光染色观察伤后不同时点视网膜中PAR-2的表达分布情况；建立大鼠RGC-5缺氧损伤离体模型，采用荧光定量PCR和western blot检测缺氧培养RGC-5细胞内PAR-2的表达规律。②建立大鼠RGC-5细胞缺氧损伤离体模型，定量检测细胞凋亡率，观察PAR-2活化对缺氧诱导RGCs凋亡的影响，初步探讨可能涉及的凋亡途径。③建立视神经钳夹伤在体模型，行视网膜冰冻切片，观察伤后α晶状体蛋白与PAR-2在视网膜中的表达与定位；免疫共沉淀法进一步检测α晶状体蛋白与PAR-2在视网膜中的相互作用。④建立RGC-5细胞缺氧损伤离体模型，检测缺氧后α晶状体蛋白与PAR-2在RGC-5细胞中的表达与定位，免疫共沉淀法检测两者在RGC-5细胞中的相互作用。⑤构建120～154氨基酸缺失的突变型α晶状体蛋白重组腺病毒表达载体并鉴定，Western Blot明确两者在RGC-5细胞中的表达情况，免疫共沉淀法鉴定两者与PAR-2的结合能力。对比分析野生型和突变型α晶状体蛋白转染对缺氧诱导的RGC-5细胞的凋亡及PAR-2活性的影响。结果①离体及在体实验证实，正常大鼠视网膜神经节细胞上有膜受体PAR-2的表达，损伤可诱导其表达上调。②损伤条件下PAR-2活化能增加视网膜神经节细胞的存活，减缓凋亡的程度，其保护作用与增加Bcl-2/Bax的比值，降低Caspase-3的活化有关，提示线粒体凋亡途径可能参与其中。③离体及在体实验证实，损伤可诱导视网膜神经节细胞上内源性α晶状体蛋白与膜受体PAR-2的表达上调，且两者存在相互作用关系。 ④损伤条件下α晶状体蛋白可通过结合膜受体PAR-2并促其活化，发挥抑制视网膜神经节细胞凋亡的作用，初步揭示α晶状体蛋白发挥神经保护作用的分子机制。结论α晶状体蛋白发挥抗细胞凋亡的作用与结合PAR-2后促其活化有关。