肝星状细胞(HSC)与窦状内皮细胞(SEC)间交互作用在肝纤维化形成及肝血管生成中发挥关键作用,从介导HSC-SEC间交互作用的调节分子角度探索肝纤维化细胞分子机制,有助于发掘抗肝纤维化治疗的新靶点。胎盘生长因子(PGF)不同于VEGF其他亚型,仅参与病理性血管生成,作为分子治疗靶点具有明显优势!我们前期工作证实在纤维化肝组织PGF及其主要受体VEGFR1与NRP-1均表达明显增加;体外随着HSC活化PGF及其受体NRP-1、VEGFR1表达也明显增加。鉴于NRP-1和VEGFR1在SEC中表达。我们推测PGF很可能是介导HSC-SEC间作用的关键分子在肝纤维化与血管生成中发挥调节作用。本课题旨在通过体内外研究探讨在肝纤维化形成过程中PGF信号分子的表达规律、PGF在HSC-SEC间交互作用的分子调节机制、以及其能否成为肝纤维化治疗的潜在靶点,为临床防治慢性肝病提供理论依据。
hepatic fibrosis;cirrhosis;place- growth factor;hepatic angiogenesis;hepatic stellate cells
目的胎盘生长因子(PGF)是血管生成因子(VEGF)家族一员,仅参与病理性血管生成,故阻断PGF信号不影响正常血管。本研究旨在探索PGF在肝纤维化相关的血管生成中作用,并利用肝纤维化小鼠模型通过RNA干扰(siRNA)PGF表达,评估PGF能否作为抗肝纤维化治疗潜在的分子靶点。体外实验探索PGF是如何通过对肝星状细胞(HSC)和肝窦内皮细胞(LEC)生物学功能调节参与纤维化相关血管生成及机制。方法检测肝硬化组织标本PGF表达及血清PGF。在低氧刺激人HSC和LEC细胞株,检测PGF及其主要受体NRP-1、VEGFR1/2表达。应用四氯化碳和胆总管结扎诱导小鼠肝纤维化模型,在造模的同时分别给予PGF-siRNA和无靶向性对照siRNA(NTC-siRNA)。纤维化评估通过天狼新红染色定量、组织学积分、肝羟脯氨酸含量以及胶原表达;HSC活化通过体内外分析α-SMA表达;通过免疫组化或Western blot或RT-PCR检测CD31/vWF、F4/80、低氧诱导蛋白-1α(HIF-1α)蛋白与基因,分别来评估肝血管生成、巨噬细胞浸润和低氧;并检测促血管生成因子和炎症介质基因与蛋白表达,包括如VEGF、VEGFR1、VEGFR2、NRP-1、ICAM-1、CCL2、TLR2/4/9等。最后,体外通过重组PGF蛋白刺激细胞或基因沉默PGF,观察分析其对HSC和LEC生物学功能的影响,并检测ERK1/2磷酸化表达。结果(1)PGF在肝硬化组织表达增高,与健康对照组相比肝硬化患者血清PGF显著升高;(2)体内靶向性干扰PGF不仅明显抑制肝纤维化形成,减轻肝损伤与炎症,而且抑制HSC活化和肝巨噬细胞募集;(3)干扰PGF减轻肝血管生成和改善肝窦毛细血管化;(4)阻断PGF抑制CXCL10、MCP-1、CCL2、TLR2/4/9、HMGB1、VEGF和NRP-1等表达;(5)PGF在HSC或LEC活化时表达增加,重组PGF蛋白刺激促进HSC活化,而PGF干扰抑制活化;PGF调节细胞增殖、迁移、成管性以及相关调控基因的表达,该功能是受ERK1/2磷酸化控制。结论我们研究表明,在实验性肝纤维化模型中PGF具有强力的促纤维化和促血管生成作用。阻断PGF表达能明显改善肝纤维化与血管生成,这提示PGF可作为伴有血管新生的慢性肝病治疗的潜在靶点。