中文摘要：

由于流感病毒变异频繁，疫苗研制存在滞后等问题，抗流感药物仍是预防流感的重要手段。我国目前尚无具有自主知识产权的抗流感病毒药物，高致病性禽流感威胁仍然存在，研发新的抗流感病毒药物迫在眉睫。在前期研究中，我们在国内外首次发现某一种蛋白酶抑制剂能够显著抑制A型流感病毒的复制，其机制可能与病毒核糖核蛋白复合体（vRNPs）的核输出受到抑制有关。由于猪流感病毒不仅危害畜牧业生产，而且具有重要公共卫生学意义，加之生物安全防护要求低，可操作性高，所以本项目拟以猪A型流感病毒为研究对象，分析该蛋白酶抑制剂对病毒vRNPs相关基因的转录、vRNPs相关蛋白的合成、vRNPs的组装、vRNPs依赖的CRM1核输出途径等方面的影响，弄清该蛋白酶抑制剂抑制流感病毒复制的分子机制，并在试验感染猪上观察该蛋白酶抑制剂的抗病毒作用，以期为人用抗流感病毒药物研制提供分子靶点，为兽用抗流感病毒中药筛选提供理论支持。

结论摘要：

本课题的研究目标是弄清某蛋白酶抑制剂抑制猪A型流感病毒的vRNPs核输出的分子机制，并初步分析该蛋白酶抑制剂作为抗流感病毒药物的可能性。通过3年的实施，完成了如下研究内容。（1）抗体制备克隆了H3N2流感毒株的PB1、PB2、PA、NP、M1、NS2、M2基因，构建了原核表达载体，表达并纯化了重组蛋白，免疫动物制备了抗体。采用western blot和免疫荧光等技术分析了制备抗体的特异性，并对病毒蛋白的表达时相进行了分析，获得了病毒感染过程中主要蛋白的表达时相。（2）细胞泛素化分析由于蛋白酶抑制剂能够调控细胞泛素系统，我们分析了病毒感染后细胞泛素化的水平，发现了病毒感染能够提高细胞整体泛素化的水平。但是，具有抗病毒作用的p53泛素化水平明显下降，进一步研究发现病毒NP具有抑制p53泛素化作用，激活了p53，而病毒蛋白NS1具有抑制p53活性的作用。（3）蛋白酶抑制剂抑制vRNPs核输出机制蛋白酶抑制剂处理病毒感染细胞，发现了蛋白酶抑制剂能够抑制病毒复制、基因转录、蛋白质合成以及vRNPs的核输出。进一步研究发现蛋白酶抑制剂抑制病毒NP、NS1、M1基因的表达和蛋白合成，造成vRNPs不能正常组装，影响了vRNPs的核输出，阐明了蛋白酶抑制剂抑制病毒vRNPs的核输出及其复制的机制。（4）泛素化系统在病毒复制中的作用分析使用泛素连接酶E1抑制剂处理病毒感染细胞，发现了E1抑制剂能够抑制病毒复制，表明泛素化系统在病毒复制中发挥重要的作用。（5）动物实验病毒感染动物后用蛋白酶抑制剂进行治疗，发现蛋白酶抑制剂能降低感染动物肺组织中病毒滴度，减轻肺部炎症，延长了病毒感染小鼠的平均存活时间，降低死亡率，保护率达60%。 （6）中药单体抗流感作用分析筛选了多种与蛋白酶抑制剂结构类似的中药单体，分析了在动物体内抗流感病毒作用。发现中药单体CU和QU对攻毒后动物保护率能达到100%，MY、Sh和Ge的保护率为80%，KA的保护率为70%，显示了这些中药单体具有潜在治疗价值。（7）发表SCI论文4篇，其中影响因子5分以上1篇，4分以上2篇，2分以上1篇。申报专利2，培养博士研究生1名，硕士研究生2名。课题阐明了蛋白酶抑制剂抑制猪流感病毒vRNPs的核输出及其复制的机制，并获得了具有潜在治疗价值的抗流感病毒中药单体，完成了任务书所有的研究内容和考核指标。