中文摘要：

糖蛋白及其表面的Ｎ－寡糖是一类十分重要的糖生物大分子，在医药、免疫诊断和营养中有着广阔的应用前景。大量合成糖肽和制备Ｎ－寡糖将极大地推动糖生物学和糖基化工程的研究和发展。目前，合成带有天然糖蛋白完整糖链的糖肽和复杂生物低聚糖Ｎ－寡糖十分困难。本项目研究从自然资源中廉价的糖蛋白大量制备N-寡糖及利用Ｎ－寡糖酶催化合成糖肽的技术方法。项目利用已构建的细菌来源的糖酰胺酶PNGase-F的酵母表面表达细胞固定化酶，建立大量制备N-寡糖的水解反应体系，水解释放糖肽的N-寡糖，并建立N-寡糖的分离、纯化和检测系统。同时采用PCR技术克隆酵母来源的糖酰胺酶PNG1基因，建立啤酒酵母EBY100的表面表达体系及大肠杆菌的高效表达体系，进而利用PNG1水解反应的逆反应即糖苷键合成反应以寡糖和多肽为原料合成糖肽。项目的完成，将为寡糖制备和糖肽合成开拓一条新的途径，该项技术属国内外首创。

结论摘要：

在大肠杆菌中高效表达来源于脑膜炎脓杆菌ATCC 33958的N-糖酰胺酶F基因，获得高量表达的重组酶15mg/L，酶性质研究发现，该酶对于变性后的底物具有更强的脱N糖基活性。N-糖酰胺酶Ⅰ属于转谷氨酰胺酶超家族，具有脱N-寡糖基活性,推测其具有催化逆反应活性，为此在大肠杆菌中克隆表达来源于酵母的N-糖酰胺酶Ⅰ基因，研究发现该酶活性与底物的变性程度有关，对变性后的核糖核酸酶B具有更强的脱N糖基活性，该酶与来源于酵母的Rad23蛋白结合后，可形成复合体，该复合体具有更强的稳定性和脱糖基活性。对N-糖酰胺酶1基因进行定向改造，发现改造后的N-糖酰胺酶1-ΔH1失去了区分正确与错误折叠糖蛋白的作用，失去了区分高甘露糖型和复杂型糖蛋白的能力，可以对复杂型的人转铁蛋白进行脱N糖基，与原酶相比，具有更强的脱N糖基活性。从卵黄中已初步分离到含复杂型糖链的糖肽，并合成的含有N糖基化识别序列的八肽，现正以上述糖肽及八肽为底物，对N-糖酰胺酶1转糖链性质进行研究。