中文摘要：

干细胞分化的卵母细胞减数分裂成熟一直是干细胞研究的难题之一。本项目基于Bmp-4基因促进胚胎干（embryonic stem，ES）细胞向生殖细胞分化的研究结果，通过Bmp-4 基因的瞬时过表达，诱导小鼠ES细胞最大限度地分化为早期生殖细胞，并通过生殖细胞特异表达基因Vasa启动子驱动绿色荧光蛋白GFP表达的信号，分选出由ES细胞分化来的早期生殖细胞。基于STRA-8和DAZL对生殖细胞减数分裂的调节作用，通过Stra-8和Dazl 基因的瞬时过表达，促进ES细胞分化的二倍体生殖细胞顺利通过减数分裂，形成单倍体的卵母细胞。本研究借助Vasa-GFP 早期生殖细胞的报告模型,获得较纯的ES细胞分化的早期生殖细胞，采用体外合成mRNA转染细胞实现基因过表达的技术，可以突破基因过表达研究中的基因时序性表达问题，更好地模拟体内生殖细胞发育、分化过程，以期获得有功能的卵母细胞。

结论摘要：

本项目通过对体外培养的小鼠皮肤干细胞添加RA进行分化，获得了与体内PGC分裂状态、甲基化状态非常相似的原始生殖细胞样细胞（PGC-LCs），并通过Dazl基因的过表达，获得基因表达模式与体内卵母细胞相似的卵母细胞。 1原始生殖细胞样细胞（PGC-LCs）的获得通过体外添加RA获得原始生殖细胞样细胞（PGC-LCs），说明RA对PGCLC的增殖可能具有促进作用。通过BrdU检测PGC-LC的增殖情况发现5μm和10μm的浓度的RA对PGC-LC的增殖具有明显促进作用。通过流式细胞仪分析发现，添加5μm的RA时，PGC-LC处于分裂时期的细胞数最多，说明这个浓度是使PGC-LC大量增殖的一个最适宜浓度。Q-PCR检测PGC-LC增殖相关基因CCND1和CDK-2，发现在5μmRA组，这两个基因有一个高表达量，并且这一结果在4天和8天的PGC-LC都表现出来。通过添加抑制剂发现RA主要通过RARβ来发挥相应的作用。 2原始生殖细胞样细胞（PGC-LCs）向生殖细胞的转化通过两组方法将Dazl基因转入体外诱导的PGC-LCs，一种是脂质体转染， 一种是慢病毒转染法。结果表明Dazl基因的过表达可以促进减数分裂相关基因Stra8, Rec8和Dmc1的表达，且在PGC-LC分化的15天时表达量最高。将24孔板内悬浮的PGC-LCs收集并转入卵母细胞培养液，第7天会出现少数直径比较大的细胞，在第10天左右，细胞变化明显，出现数目众多直径在40 μm以上的大细胞，在诱导分化的第12天，很多细胞的直径达到50 μm，并且形态上类似早期卵母细胞。 3体外诱导的卵母细胞鉴定通过细胞免疫荧光染色的方法对卵母细胞特异基因进行染色分析。结果显示，分化的卵母细胞在细胞质表达DAZL、MVH和ZP3。