中文摘要：

针对大骨节病关节软骨细胞代谢异常涉及途径环节不明的关键问题，以前期全基因芯片筛选结果所获大骨节病软骨细胞损伤的差异基因表达谱分子生物学特征为基础，采用基于人软骨样本与基因功能研究相结合的方法，应用原位杂交、体外细胞培养、Western blot、RT-PCR等技术，从人体、细胞、基因、蛋白水平不同层次，首先对已得代谢异常密切相关PAPSS2、FABP4等基因基于人软骨样本的多层面筛选验证，籍此为基准，构建联合表达载体，体外转染大骨节病和正常人关节软骨细胞，利用RNAi目的基因功能研究技术检测关节软骨细胞基质蛋白、硫酸软骨素、透明质酸酶等代谢途径的干扰表达情况，力求从不同角度阐明关节软骨代谢障碍途径及其干扰效果，以此了解大骨节病软骨代谢病变关键，更深层面探索软骨慢性损害机理及防治途径，为提高大骨节病早期诊断、早期预防的水平，提供新的科学依据。

结论摘要：

目的研究大骨节病差异基因功能，在骨与软骨细胞中的作用及通路。方法1) 收集正常软骨、大骨节病软骨、骨关节炎软骨通过免疫组化和免疫组化方法，对比研究骨关节炎、大骨节病、正常软骨，及软骨细胞细胞中差异基因表达情况；2）从小鼠不同组织提取RNA，通过Real time PCR 研究选定基因在不同组织中的表达情况；3）培养MC3T3细胞，RAW264.7，免疫组织化学，Western blot，Real time PCR观察该基因在基因、蛋白、组织水平不同细胞种类表达情况；4）通过构建低表达与高表达载体，shRNA慢病毒及逆转录病毒导软骨与骨细胞，RNAi，检测基因沉默、高表达或干预后骨细胞茜素红染色和von Kossa染色钙沉积、碱性磷酸酶、成骨标志及硫代谢相关等基因的表达情况。MC3T3-E1细胞的P-Smad2/3、ERK通路及TGF通路等蛋白的水平。3）通过生物信息学分析，深入研究PAPSS2、FABP4、Collgen在骨与软骨细胞代谢中的作用，探索KBD 软骨损害途径。结果PAPSS2、FABP4、Col24a1 mRNA的表达在骨和成骨细胞分化过程中起的作用。成骨细胞高表达PAPSS2、FABP4、Col24a1促进成骨细胞的ALP活性和矿化。1型胶原蛋白和OPN的表达衰减，过度表达时增加。PAPSS2基因在骨关节炎、大骨节病中的高表达；PAPSS2、FABP4、Col24a1可以促进成骨细胞分化，促进成骨细胞钙化，增加COL1和OPN表达。PAPSS2调节成骨细胞Smad通路，增强ALP活性和矿化,PAPSS2上游的OPN诱导行为，直接或间接调节OPN活性和成骨基因的表达。结论 PAPSS2、FABP4、Col24a1对正常的骨骼发育是非常重要与大骨节病骨骼发育异常密切相关。PAPSS2等沉默显著抑制的Smad 2/3，TGF -β信号通路的关键转录因子的mRNA表达。Col24a1调节成骨细胞的ALP活性和细胞矿化，并通过TGF-β/Smads信号通路可能。PAPSS2通过ERK信号通路的促进ATDC5成软骨细胞分化和基质形成。FABP4通过TGF-β信号途径影响骨与软骨生成发育，与BMP信号转导途径密切相关。