中文摘要：

肿瘤侵袭和转移是患者预后不良的最主要因素之一，缺氧在肿瘤侵袭和转移过程中发挥的作用日益受到重视。申请者在前期国科金资助下发现了一个新的缺氧反应分子-MGr1-Ag，后续的研究证实该分子能够促进肺癌细胞的侵袭和转移，但其机制尚不清楚。近年来，EMT在肺癌侵袭和转移中的作用备受关注，我们前期的结果提示外源性高表达MGr1-Ag能够促进肺癌细胞EMT 的发生，而抑制MGr1-Ag的表达能够逆转缺氧诱导的肺癌细胞EMT的发生。提示MGr1-Ag是缺氧诱导肺癌细胞发生EMT的新分子。但MGr1-Ag在缺氧诱导EMT中的信号通路和分子机制尚不清楚。本课题拟采用siRNA干涉、报告基因、Western Blot、染色质免疫共沉淀等方法探讨缺氧条件下MGr1-Ag促进EMT的机制以及EMT在肺癌侵袭和转移中的机制，为靶向治疗肺癌提供新的理论依据。

结论摘要：

为了证实MGr1-Ag/67LR在肺癌骨转移中的作用，首先构建了的MGr1-Ag的高表达和低表达细胞系，我们利用体外模拟体内骨微环境的骨片粘附试验以及尾静脉骨转移瘤模型证实了MGr1-Ag/67LR是肺癌转移相关的新分子，并通过EMT机制促进了肺癌骨转移的发生。为了探讨缺氧活化的信号通路以及对MGr1-Ag的影响，首先我们检测了常氧条件和缺氧条件下MAPK/JNK信号的表达变化，结果显示，随缺氧时间的不断延长，MAPK信号通路中的p-38MAPK、ERK和JNK蛋白的磷酸化水平不断升高，且呈时间依赖性。进而，为了明确这条信号通路与缺氧诱导MGr1-Ag/37LRP的相关性，我们使用了不同剂量的38MAPK、ERK和JNK的特异性抑制剂SB203580、U0126和SP600125分别处理细胞后对MGr1-Ag的影响，结果发现，SP600125和U0126能够明显抑制缺氧状态下肺癌细胞A549中MGr1-Ag/37LRP的mRNA水平、蛋白水平）和转录活性，而SB203580处理细胞后对MGr1-Ag无影响。为了进一步探讨MAPK激酶下游转录因子c-jun的活化参与了缺氧诱导的MGr1-Ag的表达，我们构建了c-jun的siRNA，转染入肺癌细胞A549后，经缺氧条件处理后，抑制c-jun的表达后，缺氧诱导的MGr1-Ag 的蛋白表达、mRNA水平和转录活性均受到抑制。为明确MGr1-Ag启动子上游546bp中AP-1关键的结合位点，首先，针对双荧光素酶筛选的MGr1-Ag启动子中包含AP-1 结合位点的启动子序列进行分析，设计了包含该结合位点的上下游引物，利用染色质免疫共沉淀的方法（包含-271的结合位点）扩增出约200bp的阳性条带。提示MGr1-Ag启动子上的AP-1的结合位点存在于该区域中。进而，通过双荧光素酶报告基因系统和凝胶迁移率的方法明确了在MGr1-Ag启动子转录起始位点的-423 to +123的546bp存在潜在的AP-1的结合位点。最后，使用MGr1-AgsiRNA、中和抗体以及MAPK激酶阻断试验针对缺氧和常氧条件下肺癌细胞的体外侵袭能力进行了研究。体外侵袭实验的结果提示，缺氧有促进肺癌细胞侵袭入细胞外基质的能力，而抑制MGr1-Ag、ERK或JNK后MEK均能够减少缺氧诱导的侵袭。