中文摘要：

本研究是在前期国家自然科学基金的结果上提出的，是相关研究的持续、深入和探索，所涉及的VEGF研究内容在该领域属国际前沿。从表观遗传学水平出发，通过RNA干涉、western blot、免疫组化、RT-PCR、限制性片段长度多态性分析法(RFLP)、ELISA、亚硫酸氢钠测序法等技术，深入探讨VEGF对羊卵母细胞体外成熟和胚胎发育过程中对Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt1o的mRNA 和蛋白表达；印迹基因Igf2R、Peg1、Snrpn、H19 mRNA 表达；印迹基因Igf2R、 Peg1、Snrpn、H19印迹表达和转录活性的影响，并与体内羊早期胚胎相比较。深入研究VEGF在促进羊卵母细胞体外成熟和胚胎体外发育过程中对印迹基因和Dnmt家族表达的影响、各个基因印迹和Dnmt家族表达与较高卵母细胞成熟率和胚胎发育率之间的关系，以及与体内环境下各基因印迹表达和Dnmt家族表达的差异。

结论摘要：

项目按照计划基本完成了大部分试验内容,具体结果如下:1.采用电转染方法，将针对血管内皮生长因子（VEGF）两受体FLT1和KDR各设计的3条双链小RNA干扰片段导入到颗粒细胞内。通过比对颗粒细胞生长曲线变化及检测FLT1和KDR在颗粒细胞生长过程中mRNA表达变化，从中筛选出能有效干扰FLT1和KDR mRNA表达的两条干扰片段。2.通过外源添加 VEGF及显微注射两有效干扰片段，采用实时荧光定量PCR对三种不同体外培养方式（COCs培养、裸卵培养、卵母细胞与颗粒细胞共培养）的卵母细胞生长发育过程中印记基因、DNMT家族以及VEGF和其两受体mRNA的表达进行检测。结果表明COCs的培养方式下添加VEGF比不添加DNMT1、DNMT3a的表达量低。而在裸卵培养条件下DNMT1的4h和18h表达量要都高于裸卵与颗粒细胞共培养的条件下的，且变化幅度略大，DNMT3a则相反。只单纯添加VEGF可以令DNMT1的4h和18h、DNMT3a的4h表达量在裸卵和裸卵与颗粒细胞共培养条件下减少。添加VEGF和其一种干扰片段比同时添加两种干扰片段对DNMT3a表达量的影响作用要大，尤其是在裸卵培养条件下这一作用更明显。无论何种形式DNMT3b表达量18h的低于4h的，裸卵条件下的DNMT3b 4h和18h表达量略高于裸卵与颗粒细胞共培养条件下的。VEGF添加及其干扰片段导入与否对H19、PEG1/MEST表达无影响，而IGF2R表达量18h的显著低于4h的，SNRPN则相反。在裸卵条件下的各处理方式IGF2R、SNRPN表达量低于裸卵与颗粒细胞共培养条件下的。添加VEGF和干扰片段有效的减少了IGF2R、SNRPN表达量，影响显著。3.VEGF能够明显地影响卵母细胞和颗粒细胞内VEGF、FLT1以及KDR的mRNA表达，对于其他DNMT家族和印迹基因mRNA在颗粒细胞中的表达未产生明显影响。4.采用westernblot研究COCs培养和共培养中卵母细胞VEGF、FLT1和KDR蛋白表达的影响。结果表明FLT1的干扰片段加入使得FLT1蛋白量有所下降。VEGF的外源添加还会导致卵母细胞中KDR含量的上升，但效果不显著。卵母细胞中KDR的合成对颗粒细胞的依赖性较小。对FLT1进行干扰则会导致KDR含量的逐步上升；对KDR的干扰则显著地降低了KDR在卵母细胞中的表达。