中文摘要：

血友病B是一种因凝血因子FIX基因缺陷导致的先天性凝血障碍性疾病，传统的药物治疗方式并不能根本性治疗遗传性的血友病，并且受到诸多限制。本研究利用核糖体基因区适于基因靶入治疗的优势，结合干细胞治疗，尝试将其应用于血友病B的基因治疗研究。本课题拟设计并构建携带凝血因子FIX的鼠源性核糖体基因区打靶载体，打靶鼠mESC细胞，高效筛选定点整合的mESC细胞克隆。体外验证FIX正常表达及凝血活性，同时验证定点整合FIX的mESC克隆的全能性,并最终通过嵌合体小鼠的形成实验验证核糖体基因区打靶载体的安全性和有效性。为凝血功能障碍等疾病的基因治疗提供新的依据及参考。

结论摘要：

血友病B是一种因凝血因子FIX基因缺陷导致的先天性凝血障碍性疾病，传统的药物治疗方式并不能根本性治疗遗传性血友病，并且受到诸多限制。本研究利用核糖体基因区（rDNA）适于基因靶入治疗的优势，结合干细胞治疗，尝试将其应用于血友病B的基因治疗研究。我们首先通过生物信息学查找并分析小鼠核糖体基因区启动子区和转录区，针对转录区18S上的+5646位点设计并构建鼠源性核糖体基因区打靶载体pMrn，同时引入了近年新兴的靶向基因组编辑技术TALEN系统以提高rDNA区打靶效率。将pMrn与TALEN通过核转染导入至小鼠胚胎干细胞（mESCs），经药物筛选后，PCR及Southern Blot鉴定出定点整合rDNA区的mESCs克隆。在此基础，进一步通过载体中设计的Cre-loxp系统，成功在已打靶的mESCs中实现外源FIX表达框与筛选基因Neo的重组交换，重组后的mESCs具有正常核型及多能性。同时我们在人的ESCs中，验证了FIX表达框打靶rDNA区后能正常表达并分泌。此外，由于iPSCs技术的出现，为实现自体化基因治疗开辟了崭新途径，我们还通过收集和分离血友病人的尿液细胞，成功诱导出了血友病人特异性的iPSCs。因此本项目的研究结果为凝血功能障碍等疾病的基因治疗提供了新的依据及参考。