紫草宁及其衍生物是紫草科植物合成的一种具有多种药效的次生代谢产物。本研究拟以本室所获得的两种滇紫草细胞系(黑暗培养时合成、光照培养时不合成紫草宁的正常细胞系;黑暗培养时不合成紫草宁的突变细胞系)为试材,联合应用SSH和cDNA芯片等先进技术,以各种细胞系(黑暗、自然光照、不同波长光源培养的正常细胞系;突变细胞系)的cDNA为探针,对与紫草宁合成相关的差异基因进行大规模表达谱分析,鉴定、克隆主要的相关基因(包括可能的新基因、转录因子、信号转导相关基因、抑制和促进合成的基因等),并通过筛选cDNA文库或RACE等方法克隆其全长,进而转基因研究某些重要基因的功能、定位、表达调控等。本研究综合应用了不同的细胞系及培养条件来分析相关基因的大规模表达谱,并将与现已开展的生理学研究结果协同分析,从而能较为系统地阐明紫草宁合成代谢及其分子调控的多基因协同作用机制,为调控紫草宁的合成及其它次生代谢提供依据。
紫草宁及其衍生物是紫草科植物合成的一种具有多种药效的次生代谢产物,研究其合成调控的分子机制具有重要的意义。(1)本研究以滇紫草细胞系为试材,以黑暗培养的细胞RNA为driver,以光照培养的细胞RNA为tester,构建了4个抑制消减杂交文库。(2)同时,为克隆重要基因的全长cDNA,构建了高质量的全长cDNA文库。(3)以文库中的克隆制备了紫草细胞的个性化cDNA芯片,并以黑暗培养的紫草细胞RNA为对照方,以不同光源(白光、蓝光、红光)培养的细胞RNA为试验方,进行了芯片杂交。(4)通过对基因表达谱的分析,分离和鉴定了一系列可能与光信号和紫草宁合成相关的重要基因。(5)提出了乙烯在光信号调控紫草宁合成中作用的可能的分子机制模型。(6)研究还发现,内源NO、H2O2、Ca2+/CaM等信号分子参与了黑暗培养时M9生产培养基中紫草宁的合成调控。(7)建立了高效的紫草细胞基因枪遗传转化体系,并构建了乙烯合成和信号转导重要相关基因的过表达和RNAi植物表达载体,筛选到了稳定的转基因抗性愈伤组织,为研究这些基因的功能奠定了基础。