中文摘要：

重组E.coli产丁二酸过程需要好氧与厌氧两阶段培养，好氧培养的细胞生理状态对厌氧培养合成丁二酸至关重要。然而目前对细胞生理状态的监控依赖于离线测定丁二酸合成途径中相关酶活性间接判别，操作繁琐、耗时，且细胞生理状态随着培养环境在不断变化，很难实现对细胞生理状态的准确监控。利用近红外检测技术不仅可以实现对物质组分定量测定，而且可以对物质性质进行模式识别。本项目采用偏最小二乘、支持向量机等化学计量学方法解析重组E.coli产丁二酸过程中近红外光谱数据并建立判别模型对发酵过程中不同细胞生理状态进行识别，结合近红外光谱定量模型对细胞量、底物、产物等参数的在线监控，实现对重组E.coli好氧培养与厌氧培养多次切换的多阶段培养，调节良好的细胞生理状态，达到丁二酸高效、可控生产。本项目对于开发近红外光谱检测技术用于发酵过程优化控制具有借鉴意义。

结论摘要：

本项目通过研究E.coli两阶段发酵产丁二酸的过程特征，在好氧培养采用限制性补糖策略，可以调节丁二酸合成途径过程中酶活，提高厌氧阶段丁二酸的生产效率；但随着厌氧阶段有机酸积累、渗透压增加，丁二酸生产效率降低。在厌氧发酵结束，对发酵液进行好氧培养，细胞可以利用培养液中的有机酸进行生长，可以重新调节细胞的生理状态，此时再转至厌氧培养可以继续提高丁二酸生产效率。为了提高好氧-厌氧切换培养的操作效率，采用主成分分析、偏最小二乘、支持向量机等化学计量学方法解析重组E.coli 两阶段产丁二酸过程中近红外光谱数据并建立对底物、产物、细胞量测定的定量模型，并通过小波变换、异常值剔除等手段，降低操作条件对近红外光谱模型的影响，从而建立高精度的近红外定量测定模型，对丁二酸发酵体系中细胞量、底物、产物等参数在线监控，模型预测的标准偏差均小于0.2g/L。此外，细胞的生理状态与胞内酶活性有着直接关系。课题分析了胞内酶活性与细胞生理状态的关系。胞外酶活测定分析发现，限制性补加葡萄糖提高了反TCA循环支路和乙醛酸途径的关键酶活性（如磷酸烯醇式丙酮酸激酶PCK，异柠檬酸裂解酶ICL），有利于胞内代谢的氧化还原平衡，进而提高了丁二酸的收率和生产强度，通过酶活性将近红外光谱与细胞生理状态相关联，建立细胞生理状态进行模式识别的判别模型，实现不同培养环境下细胞生理状态的识别。通过利用近红外定量模型测定底物、产物、细胞量，以及近红外判别模型识别细胞生理状态，通过重组E.coli好氧培养与厌氧培养多次切换的多阶段培养，维持良好的细胞生理状态，丁二酸产物浓度达到115.6 g/L，质量收率达到0.85g/g，生产强度达到1.8g/L？h。在项目开展过程中，参加了中国生物工程学会2012年学术年会暨全国生技术大会以及生物质能源技术国际学术研讨会等国内学术会议，对项目进展情况进行了交流与讨论。项目顺利完成研究任务，申请国家发明专利1项，发表SCI论文11篇，培养硕博士研究生8名，达到预期目标。