中文摘要：

项目拟在前期声动力学疗法对鼠系腹水瘤细胞抗癌作用研究基础上，追踪当前细胞自噬性死亡研究最新进展，通过筛选杀伤和诱导不同白血病细胞凋亡和自噬性死亡的理化参数，建立SDT诱导白血病细胞自噬性死亡的细胞模型，研究低频低强度聚焦超声结合原卟啉IX对人不同白血病肿瘤细胞的杀伤作用，探讨SDT引发不同白血病细胞的多种死亡模式及其机制。利用形态学观察、生理功能分析、分子生物学检测等研究技术，重点探讨SDT激活白血病细胞自噬性死亡相关理化因子的临界阈值、细胞作用靶点、信号通路调控和基因表达变化；采用加入自噬性细胞死亡特异性抑制剂和凋亡相关Caspase广谱性抑制剂，分析白血病细胞死亡模式变化及相互关系，探讨细胞凋亡与细胞自噬性死亡、坏死等不同死亡模式在SDT抗肿瘤效应中的主导作用和细胞差异性；为SDT用于白血病个体化临床治疗，特别是自体干细胞移植物的体外净化，降低移植后肿瘤复发提供理论和实验依据。

结论摘要：

项目针对声动力学疗法（SDT）诱导白血病细胞的不同死亡模式及相关机制进行研究，以不同白血病细胞为研究模型，筛选出PpIX-SDT诱导肿瘤细胞发生自噬和凋亡的参数阈值，通过形态观察、生理功能分析和分子检测等鉴定细胞自噬和凋亡的典型特征，然后通过抑制剂实验分析自噬与凋亡之间的互作关系，对SDT作用的可能机制进行探讨。已取得的研究成果如下 ①SDT诱导细胞自噬活性的提高依赖很大范围内PpIX剂量和超声强度变化，结合细胞存活能力检测结果，选择的最佳SDT参数为PpIX浓度1 μg/ml，超声强度为1W/cm2。单纯PpIX和单纯超声产生很轻微的细胞毒作用，而二者协同作用产生明显抗肿瘤效应，细胞存活率下降了近40%。 ②TEM观察、免疫印迹和免疫荧光技术证明了SDT可诱导白血病细胞自噬发生，且其发生在SDT作用后早期阶段，随孵育时间延长逐渐减弱。 ③SDT处理后6 h，SEM观察到细胞体积缩小和膜表面起泡现象；DAPI荧光染色显示染色质凝集；胞内Caspase-3活性明显增强，且可被Caspase抑制剂z-VAD所抑制；免疫荧光和流式细胞仪分析显示，SDT处理后，细胞凋亡的其它特征如线粒体膜电位下降、Bax/Bak转定位、Bcl-2蛋白表达受损、细胞色素C释放等非常明显且呈时间依赖性，提示线粒体凋亡通路在SDT抑制白血病细胞增殖方面起重要作用。 ④抑制剂实验表明SDT诱导细胞内自噬体的形成发生在凋亡的早期；自噬抑制剂3-MA或Ba A1增强了SDT诱导的细胞凋亡和细胞存活率的下降；Caspase抑制剂z-VAD抑制了细胞凋亡但并不能最终抑制SDT引发的细胞死亡，提示SDT诱导细胞死亡存在多种模式和途径。SDT联合自噬抑制剂可增强SDT抗肿瘤疗效。 ⑤SDT处理后胞内ROS显著升高，ROS清除剂NAC明显降低了LC3-II表达水平且几乎完全抑制了线粒体和Atg5的共定位；NAC可部分抑制Caspase-3活化和PARP剪切，保护了SDT诱导的细胞存活能力的下降；提示ROS在自噬和凋亡启动过程中起重要作用。 ⑥SDT处理后受损的线粒体与自噬体标记蛋白LC3和Atg5明显共定位，且可被BaA1所抑制，提示线粒体损伤是细胞自噬启动的诱因之一。而当Ba A1存在时，细胞内Bax的转定位和线粒体膜电位的下降程度均增强，表明抑制自噬而伴随的细胞凋亡增强与线粒体损伤密切相关