中文摘要：

抗血管生成肿瘤分子靶向治疗已经用于临床试验并证实有效，但血清半衰期短等因素影响其治疗效果及治疗的广泛性。临床可用于肿瘤的"自杀"基因有限、且基因需要肿瘤细胞靶向介导而且单用效力不够。本项目拟评估抗血管生成因子Endostatin结合新的自杀基因，高效多底物的果蝇脱氧核苷酸激酶基因（Dm-dNK）靶向联合杀伤实体肿瘤细胞治疗体系的构建与应用。探讨肿瘤双重打击的协同效果以及Dm-dNK/癌前药物作为肿瘤细胞血管减少后第二杀伤机制的可行性、疗效及机制；并在体外细胞系水平成功的基础上，完成早期动物试验。本项目将首次证实Dm-dNK在肿瘤细胞血管减少状态下可能存在的显著协同杀伤效果；其机理可能与促进凋亡有关；通过该项目试图寻找出另一条肿瘤杀伤、特别是转移肿瘤细胞分子靶向治疗的新途径。

结论摘要：

血管生成抑制剂，是一种新的低毒性、低耐药性的抗肿瘤治疗方式。其中，内皮他丁（Endostatin）能有效抑制内皮细胞的增殖、迁移、侵袭和小管形成，已在动物模型中显示出抗血管生成和抗肿瘤的强大作用。自杀基因疗法在靶基因组中插入所谓的“自杀基因”,编码合成的酶能使无活性的癌前药物(Prodrug)转化成细胞毒性代谢产物，通过引入Prodrug，靶细胞能有效地被迫实行自杀。此外，“旁观者效应”，能引起比转染自杀基因癌细胞更大比例的细胞死亡。与已知的脱氧核苷激酶相比，从果蝇中获得的一种脱氧核苷激酶（Dm-dNK）能在人的细胞中稳定表达并保持酶活性，高效的磷酸化天然脱氧核糖核苷及几个临床上重要的抗病毒和抗癌核苷类似物如araT, BVDU。 为了提高Endostatin的疗效，我们将Endo与Dm-dNK融合。这一治疗策略基于分别观察Endo-GFP基因和Endo-荧光素酶基因选择性靶向结合内皮细胞。项目评估了E1B缺失的溶瘤腺病毒（CRAd）为载体介导的高效Dm-dNK通过形成新的靶向抗肿瘤系统治疗实体瘤，以及Dm-dNK /prodrug作为第二杀伤机制。我们首先检测了Endo与Dm-dNK融合蛋白是否能稳定转入内皮细胞。为此，我们分别用HEK293细胞形成特定的HEK293-Endo-GFP 和HEK293分泌的GFP形成稳定的表达Endo-GFP和分泌型GFP的细胞系。荧光显微镜和Western分析证实内皮他丁和绿色荧光蛋白的表达。将Endo-GFP，分泌型GFP和内皮细胞（HUVEC和SVEC）共培养，发现内皮他丁-GFP与内皮细胞结合。Western检测培养基中的蛋白，评估Endo、分泌的Dm-dNK及Endo-Dm-dNK融合蛋白表达。酶活性实验评估Endo-胞嘧啶脱氨酶仍保持催化前药转换的酶活性，并进行了MTT。在皮下移植瘤及转移肿瘤的裸鼠模型中，我们发现注射Endo-Dm-dNK融合蛋白组较单独注射内皮他丁组、单独注射Dm-dNK组、联合注射Endo和Dm-dNK组获得了更强的肿瘤生长抑制作用，且裸鼠平均生存时间延长。Endo-Dm-dNK显著抑制内皮细胞的生长，并诱导肿瘤细胞凋亡。溶瘤和癌前药物的自杀基因双重机制能靶向杀伤肿瘤细胞；这种Endo与Dm-dNK融合的方法为肿瘤靶向治疗开辟了一条新的道路。