中文摘要：

青蒿素是目前治疗疟疾最有效的天然药物之一，但在天然青蒿中含量较低。代谢工程是提高青蒿素含量的最有效手段之一，而开展青蒿素生物合成的代谢研究是实现其代谢工程的必要前提。青蒿素前体不仅由经典的MVA途径提供，而且也由新近发现的MEP途径提供。本研究将以青蒿MVA途径中的限速酶基因HMGR和MEP途径中的限速酶基因DXR为靶基因，采用不同代谢工程策略，即打破限速步骤（过量表达HMGR/DXR）和阻断代谢途径（反义RNA降低HMGR/DXR表达），以及这两种代谢工程策略联合应用（过量表达HMGR+反义RNA降低DXR表达；过量表达DXR+反义RNA降低HMGR表达），采用转基因技术实现对青蒿MVA和MEP途径共8种方式的遗传改造，同时考察转基因青蒿的青蒿素合成能力，从而明确MVA和MEP途径在青蒿素合成的作用，为基于MVA和MEP途径实现青蒿素代谢工程提供理论依据。

结论摘要：

青蒿素（Artemisinin）是治疗疟疾最有效的天然药物，但在天然青蒿（Artemisia annua L.）中含量较低。代谢工程是提高青蒿素含量的最有效手段之一，而开展青蒿素生物合成研究是实现其代谢工程的必要前提。本研究将采用分子生物学和生物技术手段研究MEP和MVA途径在青蒿素生物合成的作用。 MeJA处理青蒿发现，MVA途径限速酶基因HMGR收到MeJA正调控，MEP途径上多个重要结构基因包括DXS、DXR和HDR都受到MeJA正调控，这有利于MVA和MEP途径合成更多的前体供给下游代谢产物的生物合成；同时发现，MeJA极显著上调FPS表达，这有利于MVA和MEP途径提供的5C前体向15C的倍半萜前体转化；青蒿素合成特有途径上中结构基因ADS、CYP71AV1、ALDH1和DBR2等都受到MeJA上调，从而导致MeJA处理下青蒿素合成增加；MeJA能够上调青蒿素合成正调控转录因子ORA的表达，这是MeJA诱导青蒿素合成途径中众多基因表达上调的分子基础。基于此，在青蒿中过量表达MeJA合成关键酶基因JMT，提高内源MeJA合成，可能导致MVA途径，MEP途径以及青蒿素合成特有途径基因表达上调，使得青蒿素含量提高。结果表明转JMT青蒿中MeJA含量始终处于较高水平，从而激活包括青蒿素在内的一系列次生代谢产物生物合成，转JMT青蒿腺毛体密度增加，发育更加完全，青蒿素含量得到大幅度提高。在青蒿中过表达HMGR基因，能够提高青蒿素含量。采用反义HMGR培育转基因青蒿，未能获得转基因材料，分析原因在于HMGR是植物MVA途径中的关键酶，MVA途径不仅为青蒿素等植物次生代谢产物合成提供前体，同时还为植物膜脂等重要从初生代谢产物合成提供底物，HMGR被抑制，影响到与植物生存有关代谢途径，导致未能获得转反义HMGR基因材料。在青蒿中过表达DXR基因，发现能够提高青蒿素含量，这是首次采用转基因方法证实MEP途径遗传改造能够提高青蒿素生物合成。同样未能获得转反义DXR基因的材料，原因在于DXR被抑制后，叶绿素合成收到严重影响，导致植株白化，不能存活。MVA途径和MEP途径遗传改造研究表明，增加这两条代谢途径产物的遗传改造方式都有利于青蒿素生物合成；这两条途径中任何一条途径被阻断，都会导致转青蒿致死。转基因结果表明对MVA和MEP途径遗传改造均能够提高青蒿素合成。