中文摘要：

米曲霉被广泛应用在工农业生产中，但最近发现现该真菌也会产生真菌毒素。环匹克尼酸（圆弧偶氮酸，cyclopiazonic acid，CPA）就是米曲霉产生的最主要真菌毒素，从其结构上看，CPA属于异戊烯基化的吲哚衍生物。它的存在给食品安全和人类健康带来潜在威胁。因此揭示米曲霉中CPA毒素的合成机制构建高安全突变菌株对于保证食品安全显得非常有必要。本课题拟从基因层面入手，结合CPA在生物体内的合成途径以及课题组成员在异戊烯基化的吲哚生物碱的生物合成方面取得的经验，进行异戊烯基转移酶基因BAE59503的表达与产物纯化，研究异戊烯基转移酶BAE62662性质，寻找并验证与CPA合成相关的关键基因，通过敲除这些关键基因达到获得不产CPA毒素高安全米曲霉菌株的目的，并将用PCR鉴定生产中应用的不同米曲霉菌株CPA基因簇的完整性，以判断其是否安全；从而为保证农产品和食品安全提供理论基础和技术支撑。

结论摘要：

摘要 米曲霉被广泛应用于工农业生产中，近年来，研究者发现该菌株有产生圆弧偶氮酸（CPA）的危险。因此，本课题针对米曲霉中CPA合成途径的关键酶的功能验证及其高安全突变菌株的构建工作进行了深入研究。本课题从基因层面入手，系统的研究了异戊异烯基转移酶BAE62662的性质，将米曲霉中的异戊烯基转移酶基因cTrpPT扩增出来后，克隆到pQE70并在大肠杆菌中过量表达。表达得到的带六个组氨酸标签的cTrpPT蛋白经纯化后，与L-色氨酸或含色氨酸的环形二肽在二甲基丙烯基二磷酸存在的体系中反应。高效液相监测产物的生成，结果显示cTrpPT在某些方面与已知的吲哚类异戊烯基转移酶具有显著差异。该酶对芳香底物具有高度特异性，但却不像其他吲哚类异戊稀基转移酶对异戊烯基化位置表现出强烈选择性。本研究还发现cyclo-L-Trp-L-Trp较其他检测的环形二肽被该酶接受的难易程度要低很多，与其他异戊烯基转移酶只有一个主产物不同，该酶的反应混合物中最少能检测到两个产物峰。氢谱和碳谱检测，包括多键碳氢关系（HMBC）、核欧佛豪瑟效应频谱（NOESY），证明在以cyclo-L-Trp-L-Trp为底物的反应体系中的酶产物分别为C7-位和N1-位异戊烯基化的产物，它们之间的比例在11.2左右。经测定，该酶对二甲基丙烯基二磷酸的酶动力学常数为2.5 mM，对cyclo-L-Trp-L-Trp的为0.3 mM，转换数为每秒0.33。通过敲除CPA合成途径中的异戊异烯基转移酶，构建了高安全突变米曲霉菌株；研究影响CPA合成的因素，发现碱性pH能够诱导CPA合成基因的表达并影响CPA的合成；调查生产中的米曲霉菌株，发现很多菌株能产生CPA，用PCR的方法能够实现快速的鉴定其CPA合成基因簇的完整性。这些工作为保证农产品和食品安全奠定了理论基础。