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目的：构建多耐药临床分离株结核杆菌rpsL基因重组大肠杆菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261／rpsL及其功能鉴定。方法：制备临床分离株多耐药结核杆菌基因组DNA，PCR扩增该株结核杆菌rpsL基因，构建及鉴定该株结核杆菌rpsL基因重组穿梭质粒PMV261／rpsL，重组穿梭质粒PMV261／rpsL电转化结核杆菌H37Rv株及其鉴定。结果：成功地构建了重组大肠杆菌-结核杆菌穿梭质粒PMV261／rpsL；重组大肠杆菌-结核杆菌穿梭质粒PMV261／rpsL电转化结核杆菌H37Rv株获得成功，并且重组质粒PMV261／rpsL电转化后的结核杆菌H37Rv株对链霉素耐药。结论：该临床分离株多耐药结核分支杆菌对链霉素耐药的机制仅仅是由于rpsL基因的93bp、94bp处碱基突变所致，耐药性是一个基因突变的结果，是单基因型。