稻瘟病菌是植物病原真菌致病机理的研究模式。本研究组发现,细胞自噬过程与稻瘟病菌的致病性密切相关,MgATG1基因缺失,稻瘟病菌细胞自噬过程被阻断,稻瘟病菌的产孢能力下降,分生孢子萌发延迟,附着胞膨压降低,致病性丧失;然而,分别缺失稻瘟病菌细胞自噬"MgATG1激酶复合体"中的其它单个基因(例如MgATG13或者MgATG17),细胞自噬过程没有被阻断,这与酵母中的研究结果不同。因此,本项目通过分析"MgATG1激酶复合体"中各个基因的功能,各基因亚细胞定位以及基因之间互作关系,揭示"MgATG1激酶复合体"在稻瘟病菌生理生化、细胞结构、形态发育及致病过程中的作用机制,阐明此复合体在稻瘟病菌致病过程中的地位,为稻瘟病菌细胞自噬分子机制和致病机理的研究奠定理论基础。
MoATG1 kinase complex;autophagy;pathogenicity;MoATG101;interaction
本研究,获得了双基因敲除突变体,细致分析了单基因和双基因敲除突变体的表型;构建了融合表达载体,通过农杆菌介导的转化,获得荧光表达突变体,对“MoATG1激酶复合体”中各个基因的时空表达和细胞定位进行了分析。基因MoATG11,13,17单独缺失,其突变体的表型与野生型相似,没有显著差异,致病性没有发生改变。然而,MoATG1和MoATG13,MoATG17和MoATG11,MoATG13和MoATG17同时缺失,菌落形态发生改变,产孢量显著下降,致病性显著降低,细胞自噬过程也受到影响。利用MoATG8在突变体中的定位情况,分析了基因缺失对细胞自噬过程的影响。结果表明,MoATG8在野生型Guy11和单基因缺失突变体ΔMoATG11,ΔMoATG13,ΔMoATG17的分布差异不大,MoATG8均能在液泡中降解。MoATG8在双基因缺失突变体ΔMoATG11::13,ΔMoATG11::17,ΔMoATG17::13中,MoATG8不能在液泡中完全降解,部分MoATG8聚集在PAS上,不能被转运到其它位置进行降解利用;Western blot的结果验证了这个结论。通过基因亚细胞定位分析,MoATG11定位在外围的膜系统上;MoATG13在细胞质中均匀分布;MoATG17聚集到特殊的点状结构上,初步定位PAS的位置。在MoATG17基因缺失的背景下,MoATG11的亚细胞定位发生改变,聚集成特殊的点状分布。利用酵母双杂交系统,对“MgATG1激酶复合体”中的基因进行了互作分析。结果表明,MoATG13与MoATG17是直接互作的,在QDO培养基上能够生长,同时能够显色。然而,其他的基因直接,没有发生直接的互作关系。利用同源比对的方法,寻找到了复合体中的新基因MoATG101,该基因与MoATG13直接互作。该结果补充了“MgATG1激酶复合体”的组成。酵母中Snf1激酶复合体与ATG1复合体之间存在互相调控的关系,因此,我们寻找了Snf1激酶复合体的各个组分,并且对其进行了初步分析。研究表明,MoGAL83,MoSNF1,MoSNF4的缺失,使稻瘟病菌的致病性完全丧失。该复合体与MoATG1复合体之间的关系,还在进一步的分析中。