中文摘要：

高血压发病因素复杂。钙激活钾通道（BK）和WNK激酶对调节血压和维持电解质平衡起重要作用，WNK1和WNK4突变可导致遗传性高血压。WNK的功能通过对多种离子通道和转运体的调控来发挥，但国内外尚无WNK对BK作用的研究。本项目将在HEK293细胞上研究WNK4对BK的调节作用。采用共聚焦激光显微镜、全细胞膜片钳法和免疫共沉淀分别研究WNK4对BK在细胞上的分布、功能的影响及相互作用；分别使用脉冲跟踪试验、蛋白酶体/质子泵抑制剂及发动蛋白探讨WNK4对BK蛋白生物合成、降解、蛋白内吞的影响机制。用32P标记细胞后进行免疫沉淀和体外激酶测定研究WNK4是否通过影响BK通道的磷酸化来改变其功能和蛋白表达。通过探索分子机制，揭示WNK和BK在调节血压和维持电解质平衡中的作用机理，阐明其在高血压发病中的可能作用，探讨高血压发病机理，为开发新的降压药作用靶点提供理论基础。

结论摘要：

WNK激酶是一种丝氨酸/苏氨酸激酶家族，WNK1和WNK4的突变可以导致假性醛固酮减少症II型（临床表现为高血压、高血钾和代谢性酸中毒）。在本课题中，我们发现WNK4野生型可以显著抑制BK通道在稳定表达BK的HEK细胞上的功能；而其无激酶活性的突变型WNK4-D321A却丧失了这种抑制功能。我们还发现WNK4激酶能抑制BK的总蛋白和细胞表面膜蛋白的表达，发动蛋白的突变体K44A则不会改变WNK4对BK在细胞表面膜蛋白的表达，质子泵抑制剂bafilomycin A1和溶酶体抑制剂leupeptin可以逆转WNK4野生型对BK总蛋白表达的抑制作用。综合这些研究结果，我们认为WNK4野生型通过减少BK在细胞膜表面的蛋白而抑制BK的功能，这种抑制作用不是通过网格蛋白介导的BK内吞增加、而可能是通过增加BK在溶酶体的降解而实现的；并且WNK4对BK的抑制作用是依赖于其激酶活性的。 此外，我们还研究了WNK1激酶对BK通道的调节作用。在稳定表达BK a亚基的HEK293（HEK-BKa）细胞上，将WNK1用siRNA敲除后以后可以显著抑制BK a亚基的功能和开放率，同时也显著抑制BK a亚基的蛋白表达、增加ERK1/2的磷酸化。反之，WNK1 在细胞上的过表达则显著增强BKa在HEK293细胞上的蛋白表达、降低ERK1/2的磷酸化，并呈剂量依赖性。当ERK1/2被敲除后则阻碍了WNK1 siRNA对BKa的表达。当用质子泵抑制剂bafilomycin A1处理HEK-BKa细胞后，同样也逆转了WNK1 siRNA对BKa的抑制作用。另外WNK1被敲除后还能增加BKa通道的泛素化。在动物实验中，当小鼠被喂以高钾饮食10天后，其肾脏中的WNK1和BKa蛋白表达水平显著增加、ERK1/2的磷酸化降低。上述研究结果说明WNK1激酶通过减少ERK1/2信号通路所介导的溶酶体对BK通道的降解，达到WNK1增强BK通道功能的作用。