中文摘要：

本研究拟解析一条可能与植物防御反应有关的甾醇或其皂苷的生物合成途径，研究该途径发挥抗病作用的方式。首先，利用Tilling技术筛选水稻2，3-氧化鲨烯环化酶基因（OsOSC9）的突变体材料，通过分析OsOSC9突变体，RNAi，以及过量表达水稻的甾醇和萜类代谢谱，推测该途径可能的下游产物，利用同位素标记的实验，鉴定下游产物，并解析代谢途径。通过对帕克醇及下游产物的体外抑菌实验，以及突变体和过量表达水稻的抗病性分析，结合代谢谱分析，鉴定抗病代谢物。分析OsOSC9基因时空表达谱信息，分析在甲基茉莉酸诱导和病原菌侵染后OsOSC9基因表达水平的变化，研究该代谢途径在抗病反应中应答方式；进一步通过启动子分析和原位杂交技术分析参与该途径的基因在水稻组织中的表达部位，阐明抗病作用的位点。本研究将阐明OsOSC9引领的植物甾醇或其皂苷在植物防御中的作用机制，并可能应用于作物的抗病育种。

结论摘要：

三萜和甾醇是植物体内一种具有多种结构和重要功能的化合物，目前发现的三萜的骨架多达200多种，它们都是由一类叫做2，3-氧化鲨烯环化酶（OSC）的萜类合酶催化产生。在水稻（Ozyra sativa L. ssp. japonica cv. Zhonghua 11）基因组中包含7个编码有功能OSC的基因，但是其生物学功能还不清楚。进化分析表明OsOSC9和水稻中参与甾醇合成的环阿屯醇合酶OsCS1关系最近，因此，OsOSC9是有OsCS1复制进化而来并有可能参与甾醇合成。本项目通过RT-PCR和qRT-PCR分析，发现OsOSC9主要在水稻不同发育事情的叶鞘中表达。我们克隆了水稻品种中花11号中的OsOSC9，通过酵母异源表达实验证明OsOSC9产物为帕克醇。采用农杆菌介导的转基因技术获得了过量表达株系和RNAi株系，利用TILLING技术筛选到了一系列的突变体材料，RT-PCR和免疫印迹分析表明在突变体和RNAi株系中OsOSC9的表达降低甚至检测不到，而过量表达株系中OsOSC9的表达明显增强，代谢物分析结果表明功能缺失突变体中帕克醇的含量检测不到，而过量表达植株中帕克醇含量显著提高。进一步的植物甾醇含量的分析表明，菜油甾醇和豆甾醇含量略微减低，谷甾醇含量明显提高，因此推断帕克醇参与植物甾醇的合成，但所占比例较少，而且存在反馈调控。突变体的生长发育情况和野生型没有明显的差异。非常有趣的是，OsOSC9在不同水稻品种间存在功能的差异，次生代谢基因的等位变异可能导致植物代谢多样性重要的分子机制。