中文摘要：

在研究抗真菌药物和真菌耐药机制中,先通过构建白念珠菌cDNA文库、制备cDNA芯片、开展芯片杂交实验，发现新的耐药表型相关基因。后又采用基因敲除技术证明RTA2是钙调神经磷酸酶通路介导耐药性产生的关键靶基因；IPF4847能介导过氧化氢诱导的细胞凋亡，是第一个被发现的白念珠菌细胞凋亡相关metacaspase基因。发现RTA2和IPF4847是潜在的抗耐药真菌新靶点。发现氧化应激通过激活Cap1p诱导耐药相关基因表达产生耐药性，大幅升高细胞内活性氧(ROS)水平具有协同抗耐药真菌作用，为抗耐药真菌提供了新思路。证明抗氧化剂维生素C辅助用药对全身真菌感染治疗不利，对维生素C用于感染性疾病辅助治疗的习惯用法提出了异议，对合理用药有指导意义。建立抗真菌药物研究技术平台，发现10b类等新结构类型的强效抗真菌先导化合物，特别是小檗碱、黄芩素有强效协同氟康唑抗耐药真菌作用，具有很大的开发应用价值。

结论摘要：

脂筏是细胞膜上富含麦角甾醇和鞘脂的区域，包含许多具有重要功能的蛋白，在多种细胞活动中发挥重要的作用。生物信息学分析表明RTA2基因编码产物是脂质转运蛋白，位于细胞膜上。本研究通过加入CaCl2、钙离子螯合剂EGTA以及钙调神经磷酸酶抑制剂（FK506和CsA）考察了唑类药物（氟康唑和酮康唑）对白念珠菌亲本菌和RTA2基因缺失菌的抗真菌活的变化，结果发现钙调神经磷酸酶通路通过其靶基因RTA2调节对唑类药物的耐药性。通过构建RTA2基因与钙调神经磷酸酶（CaN）编码基因CNA及转录因子CRZ1双基因缺失菌，表明在RTA2基因以CaN信号通路依赖的方式影响白念珠菌对唑类药物的敏感性。本项目通过构建Rta2p-Gfp的融合表达菌，发现Rta2p主要分布在白念珠菌细胞膜上，麦角甾醇和鞘脂合成抑制剂能够破坏Rta2p的细胞膜分布。利用密度梯度超速离心方法提取脂筏，我们发现Rta2p与已知脂筏蛋白（Pma1p和Gas1p）一样分布在脂筏区，而且这种分布能够被麦角甾醇和鞘脂合成抑制剂破坏；利用气-质联用技术，我们发现RTA2基因缺失并不影响麦角甾醇的合成以及在脂筏区的分布。进一步的，利用蛋白质组学技术我们发现RTA2基因缺失影响脂筏区域9个蛋白的分布，其中5个蛋白（Pma1p, Gas1p, Erg11p, Pmt2p, Ali1p）已报导分布在脂筏区域，Erg11p是唑类药物抗白念珠菌的靶蛋白。本项目还发现RTA2是白念珠菌CaN通路的靶基因，CaN通路通过RTA2调节对唑类药物的耐药性的形成，RTA2基因缺失及CaN通路被抑制时，唑类药物易对白念珠菌的细胞膜造成损伤；体内实验发现，RTA2基因以CaN信号通路依赖的方式影响氟康唑治疗白念珠菌感染的效果；在临床分离的白念珠菌中发现RTA2基因表达水平高的菌株感染小鼠接受氟康唑治疗的生存率显著降低。研究中，我们还首次发现小檗碱、黄芩素、鱼腥草素等具有强大的协同氟康唑抗耐药真菌作用，对耐药白念珠菌的协同抗菌效果尤其显著。并首次发现“氟康唑与小檗碱”合用通过两条途径使内源性活性氧大量生成①增强三羧酸循环②抑制ATP合酶活性；内源性活性氧的大量生成导致耐药白念珠菌的氧化损伤，这是“氟康唑+小檗碱”协同作用的重要机制。