中文摘要：

昆虫肌细胞钙通道是杀虫剂潜在的作用靶标，但迄今尚未有作用于这一靶标的商品化杀虫剂问世。前期研究结果提示，新型天然化合物苦皮藤素Ⅳ等可能作用于昆虫的肌肉系统，受体偶联的钙通道可能是这类化合物作用的靶标。本项申请拟制备苦皮藤素Ⅳ的单克隆抗体，结合采用免疫荧光技术、免疫酶技术、免疫胶体金技术及免疫印迹技术定位苦皮藤素Ⅳ在昆虫肌细胞上的作用受体；采用Ca2+指示剂直接测定技术及激光扫描共聚焦电镜技术结合新型荧光探针进行肌细胞中Ca2+释放动力学分析；采用"功能表达克隆技术"分离苦皮藤素Ⅳ受体蛋白的编码基因，克隆表达受体蛋白，并将这种蛋白转染293细胞，以此建立昆虫肌肉毒剂的筛选模型。本项申请的科学意义在于将在国内外首次从分子水平研究苦皮藤素Ⅳ在昆虫肌细胞中的受体，阐明其作用机理，建立一种新颖的杀虫剂高通量筛选模型，为一类以Ca2+通道为作用靶标的新型杀虫剂-昆虫肌肉毒剂的创制奠定基础。

结论摘要：

昆虫肌细胞钙通道是杀虫剂潜在的作用靶标，前期研究结果提示，苦皮藤素Ⅳ等可能作用于昆虫的肌肉系统，受体偶联的钙通道可能是这类化合物作用的靶标。本项研究通过对粘虫成虫飞翔肌肌纤维进行原代培养，并利用培养的肌细胞，采用免疫荧光技术，激光扫描共聚焦显微镜技术结合新型荧光探针(Fluo-3)等方法观察、测定了苦皮藤素Ⅳ作用下Ca2+立体分布影像及Ca2+含量的流变曲线，研究在苦皮藤素Ⅳ作用下Ca2+释放水平，对苦皮藤素Ⅳ的受体-钙通道介导的Ca2+释放水平进行动力学分析。结果表明加入苦皮藤素Ⅳ后，胞内荧光强度增强，即胞内钙离子浓度升高。苦皮藤素Ⅳ浓度越高，荧光增强越明显。间接证明了苦皮藤素Ⅳ的受体偶联的Ca2+通道是其作用靶标。由于这种荧光增强可被胞外钙离子阻断剂阻断，并在胞外无钙离子的情况下，加入苦皮藤素Ⅳ能使荧光增强，且Ryanodine受体阻断剂钌红并不影响荧光强度，表明苦皮藤素Ⅳ作用于细胞膜上的电压门控L-钙离子通道和肌质网膜上苦皮藤素Ⅳ受体偶联的钙离子通道。