中文摘要：

利用生防菌和生物农药逐步取代化学农药防治病害是现代农业重点发展的方向之一。前期我们从秦岭30余种药用植物中搜集、分离到100多株高活性内生菌，抗菌活性筛选出1株能抗30余种植物病原菌、尤其对灰霉菌、疣孢霉和水稻纹枯菌有很强抗性的生防细菌，系统鉴定为产酶溶杆菌（L.enzy mogenes）新菌株，前期研究表明该菌株胞外抗菌物质主要为抗菌肽和小分子化合物。为此，本项目拟规模化发酵培养该菌株；利用活性追踪手段，综合运用HPLC等分离方法和波谱手段，发现高活性小分子化合物，初步探讨化合物的构效关系；采用超滤、凝胶过滤、离子交换层析、反相色谱等方法分离抗菌肽，质谱法测定氨基酸序列，结合双向电泳、生物信息学、杀菌动力学等信息，明确抗菌肽理化性质。通过本项目的研究，有望发现系列广谱抗植物病原菌的活性先导化合物，为新型生物农药的研发提供备选化合物支持，并为我国研究或挖掘生物农药资源提供新菌种和新思路。

结论摘要：

Lysobacter sp. SNNU513作为一个极具应用前景的新型生防菌株，能拮抗30余种植物病原菌，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（专利保藏号CGMCC No.8375）和美国菌种保藏中心 (保藏号ATCC BAA-2621)。前期工作表明，该菌胞外抗菌物质主要为蛋白质类与小分子化合物，但具体物质尚不清楚。本项目主要完成了四方面内容（1）以LB为基础培养基，采用单因素、正交实验、响应面实验确定了最优发酵培养基与发酵工艺。优化后的培养基中SNNU 513生长速度更快、菌体数量更多，同等体积发酵液胞外蛋白质的抑菌活性和含量更高。优化前、后细菌胞外蛋白质分别为646、695种，二者共有蛋白质471种，其中具有潜在抗菌活性蛋白质共9类。优化后共有224种新蛋白表达，其中具有潜在抗菌活性蛋白4类。（2）胞外次生代谢物中分离到苯丙氨酸、鼠李糖、鸟嘌呤、2,5-二酮哌嗪类二肽等小分子化合物。（3）分离鉴定了胞外活性蛋白质。经双向电泳法全面了解SNNU513胞外分泌蛋白分子量与等电点分布范围的基础上，依次通过沉淀、超滤、凝胶过滤等手段，共获得5个活性蛋白质裂解转糖基酶、可溶性溶胞壁质转糖基酶、丝氨酸蛋白酶、α-水解蛋白酶、β-水解蛋白酶。除此之外，研究发现SNNU513能分泌更多的活性酶蛋白，但用常规手段分离易失活且分离成本高昂，而用工程菌原核表达将更快捷、高效、经济。基于此，我们完成了该菌株的基因组草图与胞内外蛋白质组学，全面获得了SNNU513的基因组信息与蛋白质信息，并对胞外潜在活性分泌蛋白14类中的6个蛋白进行了原核表达，全面研究了这些酶蛋白的理化性质。（4）Lysobacter sp. SNNU513应用研究。将gfp标记的Lysobacter sp. SNNU513导入玉米与丹参，发现该菌株不仅能在二者根系定殖，还可以提高宿主的抗病能力。SNNU513与苹果干腐病原菌拮抗实验表明， SNNU513能使病原菌菌体破碎，进而降解病原菌。目前基于Lysobacter sp. SNNU513的生物杀菌剂已在实验室温室初步试用。在项目实施完成过程中，共培养了5名硕士研究生，发表了SCI文章2篇，中文核心2篇，申请专利1项。整体来说，本项目研究达到了预期目标。该项目的完成为Lysobacter sp. SNNU513的应用奠定了理论依据。