中文摘要：

耐药性肿瘤细胞对传统的化疗与放疗具有耐受作用，成为肿瘤治疗的主要障碍。大分子药物（如蛋白毒素）虽对耐药细胞有效，却由于组织/细胞递送的扩散屏障，药物难以迁移至肿瘤深部耐药区域并进入细胞内起作用。为克服上述难题，本项目提出了基于肿瘤生物标记分子响应的"大分子前药"递药策略（1）应用穿膜肽修饰蛋白毒素，提高蛋白药物在肿瘤内的迁移能力以及细胞穿透能力；（2）以PEG化学修饰来达到长循环被动肿瘤靶向（EPR效应），同时PEG可有效屏蔽穿膜肽的穿膜能力，减少对正常组织的毒副作用；（3）以肿瘤标记分子Legumain的底物肽连接PEG及穿膜肽-蛋白毒素，底物肽在肿瘤内被酶切断，PEG脱离，令穿膜肽-蛋白毒素的穿膜功能恢复，从而靶向作用于肿瘤细胞。本研究选取Gelonin蛋白毒素及结肠癌为研究对象，应用肿瘤标记分子响应型前药式递药，为研究大分子药物体内递送及抗肿瘤治疗提供一个新的思路及技术平台。

结论摘要：

核糖体失活蛋白（又称为蛋白毒素）具有N-糖苷酶活性，可通过抑制核糖体来阻断细胞内蛋白质合成，引起细胞死亡；还可通过影响细胞凋亡通路蛋白的表达等其他机制来诱导细胞凋亡。因此具有很好的抗肿瘤药用潜力。然而，蛋白毒素的成药性较差，主要表现在以下几方面。（1）缺乏肿瘤靶向性及细胞摄取效率低；（2）半衰期短；（3）免疫原性强。上述缺点都极大地限制了蛋白毒素类药物在临床上的应用。在本课题研究中，我们提出了“大分子前体药物”的创新思路类似于前体药物的给药特征，“大分子前药”在血液循环中处于失活状态，而在肿瘤微环境中，可受高表达的生物标记分子所激活，发挥药效作用。我们采用聚乙二醇（PEG）修饰的蛋白毒素分子，PEG 的亲水性长链可有效地阻止蛋白毒素与正常细胞的作用，降低毒副反应，令蛋白处于“失活”状态。此外，PEG修饰还可延长蛋白的血液半衰期，有利于通过 EPR 作用被动靶向于肿瘤部位。我们在蛋白毒素分子中还引入穿膜肽序列与肿瘤酶底物序列，底物序列在肿瘤组织微环境内可被肿瘤酶所切断，释放出带有穿膜肽序列的蛋白毒素分子，从而“激活”蛋白毒素的入胞行为，特异性杀伤肿瘤细胞。在本课题执行期内，我们取得了以下结果 1. 我们在大肠杆菌原核表达体系中成功表达了重组Gelonin与重组TCS蛋白，并合成得到了蛋白毒素-穿膜肽偶联物。 2. 我们成功构建了肿瘤酶响应型的蛋白毒素前药系统。首先采用基因重组技术在重组TCS蛋白C末端融合穿膜肽和MMP-2酶底物肽，再采用内含肽介导的蛋白修饰技术在该融合蛋白的C端修饰PEG。 3．在细胞及动物水平验证了“大分子前药”系统在MMP-2酶的作用下的“开关”作用。该前药系统能够被肿瘤细胞高表达的MMP-2酶所激活。在荷瘤小鼠模型上验证了该“大分子前药”系统的体内抗肿瘤活性。其不仅比未经修饰的蛋白毒素分子具有更强的体内抗肿瘤活性，而且毒副作用和免疫原性都有显著下降。 4．发现该“大分子前药”系统能够逆转紫杉醇耐药肺癌细胞株A459/T对紫杉醇的耐药性，并初步探究了其逆转耐药的机制。综上所述，我们已顺利完成了所提出的目标，成功构建了肿瘤酶响应型“大分子前药”系统，并进行了较为系统的生物学评价，表明了所构建的系统具有良好的体内外抗肿瘤活性以及安全性，尤其是显示出了很好的治疗耐药肿瘤的作用。