中文摘要：

代谢工程已成为现代分子育种的主要技术手段和研究热点，设计并构建高效的代谢工程菌是代谢工程研究的最终目标。我们拟通过基元模型分析（EMA）对大肠杆菌合成莽草酸的代谢途径进行理性设计，筛选需要敲除和过量表达的靶基因，利用XerCD/dif重组系统完成大肠杆菌细胞多基因的系列删除，重建莽草酸合成途径，并结合发酵过程控制实验，揭示大肠杆菌高效合成次级代谢产物- - 莽草酸的代谢调控机制，构建高效合成莽草酸的工程菌。项目创新性主要体现在从全局代谢网络的视角利用EMA方法进行代谢途径的理性设计，来确定需要修饰的靶基因。该研究对微生物代谢途径的理性设计和重构，提供新的策略，对大肠杆菌高效、定向合成莽草酸过程中代谢网络的调节机制提供理论基础。项目的研究将建立和丰富代谢工程育种研究中新的技术思路和理论基础，对推动我国工业生物技术产业的升级具有现实意义。

结论摘要：

莽草酸是许多手性化合物等合成的重要中间体，更是预防和治疗禽流感药物“达菲”的关键原材料。微生物发酵法生产莽草酸具有生产周期短、成本低且对环境的污染少等无可比拟的优点，已逐渐成为国内外研究的热点。项目从野生型大肠杆菌CICIM B0013出发，根据细胞代谢网络分析，利用Red-Xer重组系统连续删除了野生型大肠杆菌B0013的莽草酸激酶基因aroL、aroK，葡萄糖磷酸转移酶系统(PTS)的关键酶EIICBglc的编码基因ptsG以及奎宁酸/莽草酸脱氢酶基因ydiB、编码厌氧途径产乙酸的关键酶乙酸激酶-磷酸转乙酰酶基因ackA-pta基因，并系统评价了基因删除对细胞的生长、葡萄糖代谢和莽草酸积累的影响。初步摇瓶发酵显示，代谢工程菌B0013 SA5积累莽草酸达到150 mg/L。在删除了aroK、aroK、ydiB和ptsG等基因的基础上，协同强化表达了磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(ppsA基因编码)、转酮酶A(tktA基因编码)和解除反馈抑制的DAHP合成酶(主要由定点突变的aroG*基因编码)。发酵结果显示，重组菌SA5(pTH-aroG*-ppsA-tktA)生产莽草酸的能力由上述构建的基因累加突变菌株SA5的150 mg/L提高到670 mg/L。重组菌SA5(pTH-aroG*-ppsA-tktA)在优化后的培养基中摇瓶发酵莽草酸产量为1207 mg/L，是在初始培养基中发酵产莽草酸的6.22倍。出发菌株B0013莽草酸产量为1.6 mg/L。用该发酵培养基进行上罐发酵，莽草酸的最终产量达到了14.36 g/L，是摇瓶发酵的11.9倍。发展了一种用于精确调控细胞生长与产物合成的分子开关模式。将大肠杆菌B0013-070染色体上的ldhA基因启动子(ldhAp)替换为λ噬菌体的pR-pL串联启动子，获得基于染色体水平开关控制的乳酸合成菌株B0013-070B (B0013-070, ldhAp::kan -cIts857-pR-pL)。新的重组菌通过培养温度的简单切换能够实现细胞的高密度生长和产物的高效合成。菌株B0013-070B的好氧菌体转化率提高9%，发酵阶段体积生产强度提高了51%，D-乳酸比合成速率提高了46%。项目按照要求顺利完成，获得了较好的学术成果。项目执行期间共发表标注有本基金项目的论文共8篇，其中SCI收录论文7篇，申请专利一项。