中文摘要：

虽然从天然产物中发现新药已经有100多年的历史，但是直到目前为止，能够快速筛选并鉴定出活性成分的有效手段非常有限。在所有筛选技术中，亲和色谱-质谱联用技术显示了明显的优势。但是一些固有的缺点限制其应用，如制柱步骤繁琐费时，分离效率低,柱稳定性差等。本申请拟针对这些缺点,提出发展无需固定化和制柱过程的亲和色谱-质谱联用技术，用于天然产物活性成分筛选和结构鉴定的研究。具体构想是在限进色谱柱上完成亲和选择性分离。限进色谱的填料表面由亲水高分子覆盖, 因此能够阻挡蛋白质等大分子进入填料内部的孔径，所以蛋白质能够很快流出色谱柱；而小分子则可以穿过亲水高分子层进入蔬水的孔径，得以保留和分离。此技术的优点在于不必做任何的样品预处理；可以避免亲和色谱那样的高盐浓度的流动相，容易与质谱联用。这一技术的发展将有可能为天然产物活性成分筛选提供新的手段。

结论摘要：

本项目旨在发展基于色谱分离和色谱/质谱联用技术的生物活性成份的筛选方法。传统的天然产物活性成分研究的方法是先分离纯化，再进行结构鉴定和活性测试的方法耗时费力，容易丢失微量的活性成分。为此我们发展了基于毛细管电泳（CE）和高效液相色谱/质谱（HPLC/MS）相结合的技术用于天然产物中活性成分筛选和结构鉴定。该方法中，先用CE对天然产物提取物进行活性测试，然后用HPLC半制备柱分离纯化被测试具有生物活性的天然产物提取物；再用CE对纯化的组份测活，然后根据与HPLC联用的MS提供的二级质谱，确定活性成分的化学结构。我们用乙酰胆碱酯酶为实验模型，对筛选体系进行了验证。经HPLC/MS分析确定黄连粗提物含有药根碱、巴马汀等7种活性成分，再用CE测定了经纯化后各个组份的IC50值。常用的激酶抑制剂筛选方法无法有效鉴别激酶抑制剂的结合位点。而基于亲和力的蛋白激酶抑制剂筛选方法可以通过将活性化合物与已知结合位点的抑制剂竞争结合靶激酶的方法判断活性化合物的结合位点，从而筛选出具有更高选择性，低毒副作用，高药效的潜在别构抑制剂。为此我们建立了基于亲和竞争色谱前沿分析的蛋白激酶抑制剂筛选的方法。我们设计合成了抗肿瘤药物达沙替尼的荧光探针分子用于ATP竞争型激酶抑制剂的筛选。首先测定了荧光标记后探针分子与靶标蛋白Abl 的结合常数，将其作为衡量待筛选化合物与靶标蛋白亲和力大小的标杆，如果待筛选化合物与荧光探针分子结合在靶标蛋白的同一位点，由于竞争作用，一定量的荧光探针从蛋白复合物中游离出来，通过测定待筛化合物顶替出的荧光探针浓度，依据建立的数学模型，就可以定量测定靶标蛋白与待筛化合物的结合常数。前沿亲和色谱作为一种检测配体与蛋白亲和力的方法，无需对蛋白和配体进行修饰和标记，在接近生理环境的条件下，直接测定药物与蛋白的相互作用的参数， 然后通过数学模型拟合，获得蛋白与药物的多级结合常数，结合位点及化学计量比。建立了基于前沿亲合色谱的新方法用于研究药物的别构效应。我们以人血清白蛋白(HSA)-血红素(Heme)和布洛芬(iburprofen)、华法林钠(warfarin)体系为研究模型，通过测定血红素存在下布洛芬/华法林钠与人血清白蛋白的结合常数的变化，确定了这一体系的负别构效应，同时也验证两个药物分子通过与人血清白蛋白不同的结合方式引起该负别构效应。