中文摘要：

肿瘤细胞抗原肽是极具应用前景的抗癌疫苗抗原，但细胞内抗原肽难于直接提取鉴定。近年发现肿瘤细胞产生的抗原肽主要与伴侣分子结合成复合物并诱导机体抗癌免疫反应，但对肿瘤细胞内各伴侣分子所结合的各抗原肽特性研究甚少。我们前期研究发现并制备了富多伴侣分子抗原肽复合物，研究了其免疫效应，另对结肠癌干细胞作了初步研究。本项目拟进一步地分别从结肠癌细胞和结肠癌干细胞提取各伴侣分子抗原肽复合物，以亲和层析纯化各组分，以pH梯度双向凝胶电泳分离伴侣分子与抗原肽；应用蛋白质谱技术和多肽测序确定伴侣分子所结合的各抗原肽丰度和氨基酸序列，建立主要伴侣分子的抗原肽谱；运用生物信息学方法分析伴侣分子-抗原肽的蛋白组学特性和前期免疫学研究结果，阐明其蛋白组学特性与免疫效应的关系及其机理，从而为揭示肿瘤抗原形成机制、针对肿瘤干细胞的新型抗原肽瘤苗的构建及其应用提供重要资料。

结论摘要：

肿瘤细胞抗原肽是极具应用前景的抗癌疫苗抗原，但细胞内抗原肽难于直接提取鉴定。近年发现肿瘤细胞产生的抗原肽主要与伴侣分子结合成复合物，但对肿瘤细胞内各伴侣分子所结合的各抗原肽特性研究甚少。本项目按照预定的主要实验方案，经过三年艰苦努力，顺利完成预定研究内容，具体无血清培养基培养，扩增细胞微球体以富集结肠癌干细胞；FACS筛选出CDl33+CD44+细胞为结肠癌干细胞。分别取结肠癌干细胞和普通结肠癌细胞的裂解液作SDS-PAGE分析伴侣分子表达；低温透析去除小于50KD和大于300 KD的分子，制备富伴侣分子肽混合物。进一步地以免疫沉淀方法提取纯化HSP60-肽、HSP70-肽、HSP90-肽、HSP105-肽等4种主要的伴侣分子-肽。Western Blotting结合 SDS-PAGE鉴定所获蛋白。各组分应用MALDI-TOF蛋白质谱技术确定伴侣分子分别结合的各肽的丰度、氨基酸序列和来源蛋白质，从而建立了主要伴侣分子的抗原肽谱。比较结肠癌细胞与其干细胞来源的伴侣分子抗原肽谱的差异，筛选并合成部分抗原肽与重组伴侣分子结合成瘤苗进行动物实验，结合分析前期的免疫学研究结果，发现了若干具有重要抗癌免疫学特性的抗原肽及其伴侣分子的组合，初步阐明其蛋白组学特性与免疫效应的关系。研究成果、创新点及其意义 1、成功地制备富伴侣分子肽混合物，摸索出免疫沉淀法分离、提取、纯化各伴侣分子抗原肽，并应用MALDI-TOF等新技术进行蛋白组学研究。这是本项目实验方法的重要创新点，为其它同类实验，如技术难度较大的肽类的提取、保存和鉴定具有非常重要的借鉴价值。 2、本项目在HSP60、HSP70、HSP90和HSP105等4种伴侣分子中共发现35种肽分子，其中可能成为抗原肽的有20多种,每种伴侣分子结合8—15种肽。初步确立了4种主要伴侣分子的各抗原肽的蛋白质来源、相对丰度和氨基酸序列，建立主要伴侣分子的抗原肽谱；这是本项目主要创新点，具有极重要的学术价值。 3、本项目在结肠癌细胞来源的伴侣分子抗原肽的研究基础上，着重研究结肠癌干细胞来源的伴侣分子的抗原肽谱及其免疫学特性，发现了若干有较强免疫效应的抗原肽及其伴侣分子组合。该创新点对揭示肿瘤抗原形成机制和瘤苗改建也有重要的学术价值和应用价值。本课题初步阐明了结肠癌干细胞内的伴侣分子抗原肽谱及其免疫学特性。