中文摘要：

DNA修复能力增强和凋亡抵抗是导致肿瘤细胞放疗耐受的主要原因。Ku70是重要的DNA修复和抗凋亡蛋白，我们前期工作发现cyclinA1/CDK2可磷酸化Ku70，促进其DNA修复功能；CDK2抑制剂减弱其修复功能并促进Bax活化；组蛋白去乙酰化酶抑制剂降低DNA修复功能，增强肿瘤细胞的放射敏感性。另有报道乙酰化的Ku70可释放结合的Bax而诱发凋亡；泛素化修饰能降低Ku70修复能力。以上研究提示Ku70功能受翻译后修饰（PTM）的密切调节。这些PTM如何调控Ku70功能，相互之间关系如何？本课题拟采用IP-WB、点突变、基因干涉等研究X线照射引起DNA损伤后Ku70不同PTM在肿瘤细胞中的时空分布变化及其对Ku70功能的调控，探讨Ku70PTM之间对话关系及其对肿瘤细胞放射敏感性的影响。本研究有助于进一步揭示Ku70作用的调节机制，并为以Ku70PTM调控为靶点的肿瘤放射增敏治疗提供依据。

结论摘要：

Ku70是重要的DNA修复和抗凋亡蛋白，其功能受到翻译后修饰的调控。Ku70乙酰化和磷酸化对Ku70功能有何影响，其调控机制如何？围绕这些问题我们进行了研究，有如下发现1. Ku70蛋白乙酰化与肿瘤细胞凋亡密切相关 去乙酰化酶抑制剂TSA可乙酰化Ku70，促进Bax与Ku70解离并转位到线粒体，最终促进线粒体途径细胞凋亡。但是通过Ku70siRNA下调其水平却意外的抑制了TSA诱导的凋亡，同时促凋亡蛋白Bax水平也显著下降。以蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，发现MG132抑制Ku70下调后Bax的泛素化降解，恢复Bax水平和caspase-3活性，逆转了Ku70下调对TSA诱导凋亡的抑制作用。以上结果表明Ku70一方面通过保护Bax不被降解，另一方面通过乙酰化促进Bax释放诱发凋亡。2. Ku70乙酰化受到抑癌基因ING5的调控 文献报道Ku70是组蛋白乙酰化酶P300的底物，我们首先证实Ku70和P300的相互作用。我们关注的另一个蛋白生长抑制因子ING5也可和P300相互作用，蛋白修饰组学发现高表达ING5可促进P300自身乙酰化,进而促进其HAT酶活性，我们进而发现ING5过表达促进P300介导的Ku70乙酰化，特异性P300 HAT酶抑制剂C646可显著抑制这一作用。有报道HDAC9介导了Ku70的去乙酰化，ING5基因敲减可显著上调HDAC9mRNA和蛋白水平，伴Ku70乙酰化下调，HDAC9siRNA可逆转这一过程。以上结果表明ING5可促进Ku70乙酰化，结合我们前期发现的ING5的功能，提示Ku70乙酰化可能参与了ING5抑制肿瘤增殖侵袭和促进化疗敏感性的作用。3. Ku70乙酰化和磷酸化位点的确认 通过蛋白质修饰组学的研究我们确认了肺癌A549细胞中Ku70乙酰化和磷酸化的位点，包括乙酰化的赖氨酸（K）K123、K468、K605和K206，磷酸化丝氨酸S222和磷酸化苏氨酸T455，以上位点中，除T455为已报道磷酸化位点，其余均未见文献报道。4. ING5调控Ku70磷酸化 定量磷酸化蛋白组学揭示ING5过表达可下调Ku70 T455磷酸化3.41倍，该位点磷酸化意义尚不明确。ING5可能成为调控Ku70乙酰化和磷酸化crosstalk的关键点。