中文摘要：

棉花黄萎病已严重阻碍棉花生产的发展。选育抗病品种是控制该病害唯一经济有效的途径。研究表明，利用不同来源的抗菌蛋白基因可有效提高棉花对黄萎病的抗性，但组成型表达的转基因植株育性受到影响，获得的材料不能应用。欲成功利用目的基因，选择合适的启动子至关重要。病原诱导启动子能严格地调控基因表达，使目的基因受病原菌侵染诱导而表达，提高植物的抗病性。棉花抗黄萎病基因工程方面，黄萎病菌对病原诱导启动子的诱导特性尚不清楚。因此，本项目拟克隆不同来源的病原诱导启动子,利用转基因技术研究黄萎病菌对启动子的诱导特点，筛选获得背景低、诱导速度快、活性高的启动子,为棉花和其它作物抗病基因工程提供可利用的病原诱导启动子。然后，将筛选得到的启动子序列与已获得的抗菌蛋白基因融合，构建植物表达载体并转入棉花，研究转基因棉花对黄萎病的抗性，筛选获得可利用的转基因抗黄萎病棉花新材料。

结论摘要：

棉花黄萎病严重阻碍棉花生产的发展。选育抗病品种是控制该病唯一经济有效的途径。研究表明，利用抗菌蛋白基因可有效提高棉花对黄萎病的抗性，但组成型表达的转基因植株育性易受影响。病原诱导启动子能使目的基因受病原菌侵染诱导而表达，提高植物的抗病性。为了获得抗黄萎病基因工程可应用的启动子，本项目克隆了来自烟草和土豆等病程相关蛋白基因的启动子10个，人工合成了同时含有SA和JA响应元件的启动子4个。利用SA、JA和病原菌进行诱导分析，筛选获得了可用于植物抗病基因工程的PR-1a、PRPL-1和SJ等诱导启动子3个。同时，利用这些启动子控制抗菌蛋白基因，筛选获得了抗黄萎病转基因棉花材料6份。详细结果如下 1、来自土豆的PRPL-1启动子能较快应答SA和黄萎病菌的诱导，无非诱导活性，不响应JA，盐、高温、低温和损伤等非生物胁迫的诱导。 2、来自烟草的PR-1a启动子能快速应答SA和病原菌的诱导，不应答JA的诱导，无非诱导活性；受病原菌侵染后，调控基因集中在接种部位及其邻近组织表达。不受非生物胁迫的诱导。 3、利用PCR巢式扩增方法将JA响应元件插入PR-1a启动子-604bp位置，成功构建了含有JA响应元件的PR-1a融合启动子SJ。该启动子能同时响应SA、JA和病原菌的诱导。受SA和病原菌快速高效诱导，活性高，活性持续时间长达4d，无非诱导活性。病原菌诱导后，调控基因集中在病原菌侵染部位及其邻近组织表达，不存在非病原菌诱导活性。受JA诱导，其活性持续可达4d，但反应速度和活性有待进一步提高。不受非生物胁迫的诱导。 4、利用上述3个病原诱导启动子控制抗菌蛋白基因并转化棉花。人工气候箱内，转基因棉花幼苗接种V991黄萎病菌20d，野生型棉花全部发病，病情指数达到97.8，而6个转基因棉花株系植株没有病症或仅植株下部叶片出现轻微的病症，发病率低于50%，病情指数低于20。 5、诱导启动子控制抗菌蛋白基因的转基因棉花植株生长正常，正常开花结实，完全消除了抗菌蛋白过量积累给植株生长的不良影响。该项目的顺利完成可为棉花抗黄萎病基因工程提供可应用的病原诱导启动子和抗病材料。